【 摘要】 阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬，是人和動(dòng)物腸道內寄生的一種革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，屬條件致病菌，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，死亡率高達50％以上。阪崎腸桿菌耐酸、耐高溫、耐干燥，對外界環(huán)境有較強的抵抗力。阪崎腸桿菌的微生物學(xué)檢驗方法，包括傳統細菌學(xué)培養方法及各種基于聚合酶鏈反應( PCR) 的分子生物學(xué)方法。 ．
阪崎腸桿菌(Enterobacter Sakazakii ) 是人和動(dòng)物腸道內寄生的一種革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬，一直被稱(chēng)為黃色陰溝桿菌( Yellow Pigmented Enterobacter cloacae )， 直到1980年才由FARMER和他的同事更名為阪崎腸桿菌。因阪崎腸桿菌是腸道正常菌群中的一種，屬條件致病菌，一直未被臨床引起重視，直到1961年，英國的URME NYI和FRANKLIN 兩位醫生首次報告了由該菌引起的兩例腦膜炎病例，隨后丹麥、美國、荷蘭、希臘、冰島、比利時(shí)等國家相繼報道了新生兒阪崎腸桿菌感染事件。阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎，并可能遺留嚴重的神經(jīng)系統后遺癥，死亡率20％～50％。國外文獻報道最多的是阪崎腸桿菌污染了嬰兒配方奶粉，引起嬰幼兒感染。也有幾例成年人感染病例的報告。阪崎腸桿菌分離檢測方法，國際上通常以美國FDA 2002年8月發(fā)布的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離計數” 作為經(jīng)典方法，在此基礎上做了較多的改良方法及分子生物學(xué)檢測方法。我國也與2005年8月頒布了奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法。臨床上對阪崎腸桿菌的病原學(xué)檢測方法報告較少。本文就阪崎腸桿菌的主要微生物學(xué)特性，致病性，分離檢測作一綜合性介紹，以飧讀者。
1 阪崎腸桿菌微生物學(xué)特性
1.1形態(tài)染色 阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬， 因此本菌具備腸桿菌基本形態(tài)特征：革 蘭陰性粗短桿菌，細胞大小為( 0.6～1.1 )×( 1.2～ 3.0 )， 有周身菌毛，無(wú)芽胞， 有動(dòng)力。
1.2 培養特性
12.1 營(yíng)養要求 不高，能在普通營(yíng)養瓊脂、血平板、麥康凱( MAC )瓊脂、伊紅美蘭( EMB) 瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養基上生長(cháng)繁殖。
1.2.2 培養溫度 阪崎腸桿菌具有耐熱及耐寒性，在外界環(huán)境中比其他腸道桿菌生存率強，培養最佳溫度25—36℃，在6～45℃下都能生長(cháng)，某些菌株可在47℃下生長(cháng) 。
1.2.3 菌落特征 在胰蛋白胨瓊脂( TSA)、腦心浸液瓊脂(BHI )及血平板上經(jīng) 25～36℃培養24 h后，形成1.5～2.5 mm，黃色菌落， 菌落形態(tài)有2種：一種為典型的光滑型菌落，極易被接種環(huán)移動(dòng)，另一種為干燥或粘液樣，周邊呈放射狀，不易被接種環(huán)移動(dòng)，似橡膠狀有彈性。后一種經(jīng)傳代后可轉化為有光澤的菌落。
1.2.4 菌落顏色 阪崎腸桿菌在MAC瓊脂上為無(wú)色透明菌落，在TSA及BHI上生長(cháng)為黃色菌落，在結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBG) 能產(chǎn)生紫紅色菌落，而在TSA上加 5- 溴-4-氯-吲哚-α- D- 吡喃葡萄苷( Xα-GLC ) 僅阪崎腸桿菌能產(chǎn)生蘭綠色菌落，現已作為阪崎腸桿菌快速培養的選擇性培養基，在4-甲基- 傘形酮-α- D- 葡萄糖苷( NA+α-MUG) 培養基上產(chǎn)生熒光菌落。
1.3 生化反應 阪崎腸桿菌在定名前一直被伯杰分類(lèi)為產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌，實(shí)際上是陰溝腸桿菌的一個(gè)亞種，因此與陰溝腸桿菌的生化反應有許多相似的地方。阪崎腸桿菌與陰溝腸桿菌有31％～49％的DNA序列同源性，G+C含量為57％。
MUYTJENS等在對226株(其中129株為阪崎腸桿菌，其他為陰溝腸桿菌60株，產(chǎn)氣腸桿菌19株，聚團腸桿菌18株)腸桿菌的研究中，發(fā)現阪崎腸桿菌和其他腸桿菌之間存在兩個(gè)主要的不同：阪崎腸桿菌α-葡萄糖酶苷活性均陽(yáng)性，而缺乏磷酰胺酶活性。由此認為，憑兩種酶活性檢測可將阪崎腸桿菌與其他腸桿菌明顯地區分開(kāi)來(lái)，并且將α-葡萄糖酶苷活性檢測可用來(lái)快速分離阪崎腸桿菌。
POSTUPA研究了從嬰兒配方奶粉中分離到的6株阪崎腸桿菌，發(fā)現所有的菌株都能產(chǎn)生吐溫-80脂酶。因此， 吐溫-80脂酶活性測定也可以作為阪崎腸桿菌的鑒定依據。
1.4. 抵抗力
1.4.1 耐高溫、干燥、滲透壓 阪崎腸桿菌比其他腸桿菌耐高溫，LEHNER 研究發(fā)現阪崎腸桿菌在嬰兒配方奶粉中60℃存活2.5min，并且72℃仍能存活。BREELLWER等觀(guān)察阪崎腸桿菌在58℃下能持續0.39～0.60min不死。由于阪崎腸桿菌細胞內含有大量的海藻糖酶，累積有大量的海藻糖，使得阪崎腸桿菌比沙門(mén)菌和其他腸桿菌更耐受滲透壓和干燥。因阪崎腸桿菌這些特性，使得奶粉生產(chǎn)時(shí)不易被殺滅，儲存時(shí)易生存下來(lái)。
1.4.2 耐酸性并對清潔劑和殺菌劑有較強抵抗力LEH—NER的實(shí)驗表明，阪崎腸桿菌能在 pH0.9～2下存活(胃部的酸性環(huán)境)，可能與阪崎腸桿菌周身菌毛結構有關(guān)，該菌毛結構易使細菌形成共生集合體，也易粘附在各種物體表面形成一層生物保護膜，對清潔劑和殺菌劑具有較強的抵抗力。
2 阪崎腸桿菌臨床意義
阪崎腸桿菌可引起各年齡段人群的疾病，但從已報道的病例年齡分布來(lái)看，嬰幼兒(1歲以下的兒童)是該菌感染的高危人群，特別是新生兒、早產(chǎn)兒、出生體重偏低、免疫力低下等身體狀況較差的嬰兒。感染主要引起腦膜炎、膿毒血癥、壞死性小腸結腸炎；阪崎腸桿菌引起的腦膜炎常引起腦梗塞、腦膿腫和腦室炎等并發(fā)癥，并且可引起神經(jīng)系統后遺癥，死亡率較高。成人主要是引起局部感染和菌血癥。
2.1 致病因素 文獻對阪崎腸桿菌的致病因素報道不多，所知甚少。目前所知阪崎腸桿菌致病性與類(lèi)腸毒素和內毒素有關(guān)。PAGOTTO首先描述阪崎腸桿菌可能產(chǎn)生一種毒力因子——類(lèi)腸毒素樣化合物，經(jīng)腹腔注射板崎腸桿菌劑量達10CFU／只時(shí)。18株實(shí)驗菌株均可導致乳鼠死亡，其中4例檢測到類(lèi)腸毒素樣化合物。國內許龍巖等觀(guān)察小鼠在接種阪崎腸桿菌菌液6小時(shí)后出現中毒癥狀，8小時(shí)后中毒癥狀加深，24小時(shí)后全部死亡。經(jīng)解剖發(fā)現實(shí)驗鼠小腸腫脹，有氣泡，腸壁變薄、糜爛，腸系膜血管、腹膜血管變粗、充血。最近，TOWNSEND 等發(fā)現嬰兒配方奶粉中含有細菌脂多糖——內毒素(LPS )，具有熱穩定性，能增加小腸上皮細胞通透性，促使細菌侵入腸壁中而致病。他將純化的腸桿菌屬脂多糖與阪崎腸桿菌一起經(jīng)注射入乳鼠腹腔中，能明顯提高阪崎腸桿菌穿透血腦屏障的能力，該實(shí)驗雖未明確表明阪崎腸桿菌產(chǎn)生內毒素，但推測阪崎腸桿菌的致病性與細菌內毒素有明顯的關(guān)聯(lián)。
MANGE等通過(guò)體外組織細胞培養實(shí)驗觀(guān)察到阪崎腸桿菌對人類(lèi)上皮細胞和腦微血管內皮細胞有吸附粘連特性，并形成叢生，表面形成生物保護膜。
KIM等支持上述實(shí)驗結果，他們利用不銹鋼管、玻璃管及PVC塑料管腔內壁，只要有一定營(yíng)養液和適宜溫度，阪崎腸桿菌就可以在這些管腔內吸附生存，并形成生物保護膜，抵御消毒劑等的殺傷作用。
2.2 所致疾病
2.2.1 嬰幼兒腦膜炎 自從1961 英國的FRANKHN等首次報道了2例由阪崎腸桿菌(當時(shí)被描述為產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌)引起的腦膜炎病例，隨后世界各國陸續報道了由該菌引起的嬰幼兒腦膜炎。1983年MUYTJENS等對荷蘭地區6年來(lái)發(fā)生的8例阪崎腸桿菌引發(fā)的嬰幼兒腦膜炎作了回顧性調查分析。發(fā)現未足月出生的新生兒占75％，出生時(shí)低體重 (<2000g )的新生兒易感染(6／8)，并與人工喂養奶粉有關(guān)。主要癥狀：發(fā)熱、面色蒼白，有抽搐或顫抖，張力亢進(jìn)，囪門(mén)隆出，無(wú)頸項強直。合并有菌血癥者占5／8，壞死性小腸結腸炎占2／8，死亡率高達75％(6／8 )。2例存活的病人中伴有嚴重的神經(jīng)系統后遺癥。在大部分病例的腦脊液和血液中分離到阪崎腸桿菌。Biefing等在1989年報告了3例住在冰島首都國立大學(xué)附院新生兒重癥監護室病人，1例正常出生但伴有左腦損傷，1例是Down’s 綜合癥(先天性無(wú)肛門(mén))，另1例為健康的男性雙胞胎之一，他們共同特征是人工喂養嬰兒配方奶粉5天后發(fā)病，出現發(fā)熱、精神萎靡、嗜睡、腦脊液可見(jiàn)大量的嗜中性粒細胞，培養分離均找到阪崎腸桿菌，除1例死亡外，1例發(fā)展為四肢癱瘓、癡呆，另1例為陣發(fā)性癲癇病。 BOWEN等分析46例阪崎腸桿菌感染的病例，其中腦膜炎的發(fā)病率是72％(33／42)，在33例的腦膜炎病例中有33％發(fā)展為癲癇，21％有腦膿腫，死亡率42％。
2.2.2 新生兒菌血癥 該病例最早報告的是在1979年，MONROE 發(fā)現一出生6天(體重2600g)的患兒出現低熱(38.3℃)、寒顫，白細胞偏低，其血液培養分離到阪崎腸桿菌，經(jīng)氨替比林治療后痊愈，未發(fā)生腦膜炎。
阪崎腸桿菌感染新生兒發(fā)生的菌血癥，據BOWEN對46例該菌感染的新生兒分析，其發(fā)病率是38％(12／42 )。多數癥狀較輕，如出現嚴重的膿毒血癥，死亡率可達36％。
2.2.3 新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC) ACKER等報告了比利時(shí)一家醫院的新生兒重癥監護室在1998年6—7月間共有12例阪崎腸桿菌引起的NEC暴發(fā)事件，12例NEC都經(jīng)臨床確診，這些患兒的特點(diǎn)是：均未足月出生，體重全部低于2000g，最低體重590g，平均體重只有1177g，人工喂食奶粉。胃液分離到阪崎腸桿菌7例(7／12)，肛指液分離到9例(9／12 )， 血液分離到4例(4／12)，死亡2例(2／12) 。
2.2.4 成人感染 阪崎腸桿菌引起成人感染的報告雖不很多，但從現有資料看涉及到成人各年齡段都有發(fā)生。本菌是條件致病菌，當機體因其他疾病導致免疫功能低下時(shí)，可引起菌血癥、膿毒血癥及泌尿道、呼吸道、創(chuàng )傷面感染，也可引起腦膜炎、膽囊炎。周庭銀等報告的3例阪崎腸桿菌感染其中敗血癥1例(女，45歲)，尿路感染1例(女，55歲)，中耳炎1例(男，21歲)。龔燕等報告從64例痰液中分離到阪崎腸桿菌，其中有62例(96.7％患有基礎疾�。郝宰枞苑渭膊�24例，呼衰7例，糖尿病6例，肺結核2例，肺癌2例，近期化療8例，腸梗阻2例)。最近，See等報告一個(gè)75歲老婦患多發(fā)性脾膿腫合并阪崎腸桿菌菌血癥。
3 阪崎腸桿菌微生物學(xué)檢驗
3.1 細菌學(xué)分離培養方法
3.1.1 經(jīng)典方法 所謂經(jīng)典方法，即是美國FDA推薦的“三管法” 培養分離阪崎腸桿菌的方法�；静襟E如下：(1)以無(wú)菌稱(chēng)取100、10、1g嬰兒配方奶粉用無(wú)菌蒸餾水以1：10稀釋?zhuān)浞秩芙夂?st1:chmetcnv w:st="on" UnitName="℃" SourceValue="36" HasSpace="False" Negative="False" NumberType="1" TCSC="0">36℃24h 孵育；(2)充分混勻后分別取10 ml加入至裝有90mlEE肉湯增菌培養36℃24h；(3)充分混勻后用直接涂布法或直接劃線(xiàn)接種法，在VRBG平板中孵育36℃24h；(4)從每個(gè)VRBG平板中挑取5個(gè)可疑菌落，分別接種在TSA平板25℃48～72 h；( 5 ) 在TSA平板上挑取黃色、無(wú)光澤典型菌落在API20E進(jìn)行鑒定。該方法自2002年被推薦公布以來(lái)，一直是各國沿用的阪崎腸桿菌鑒定檢測的方法，缺點(diǎn)是時(shí)間太長(cháng)，需時(shí)7天左右，靈敏度不高。
3.1.2 改良法： XαGLC選擇性顯色培養基法 該法是利用阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法，在TSA培養基中加入了5-溴-4-氯-吲哚- α-D-吡喃葡萄苷( XαGLC)作為發(fā)色基團，組成顯色培養基，稱(chēng)為(DFI) 瓊脂。該法的原理是葡萄糖苷酶水解XαGLC，釋放糖苷配基5-溴-4-氯- 吲哚，該糖苷配基在氧存在時(shí)形成色素溴-氯- 吲哚，使菌落呈現特異性藍綠色。該改良法已被廣泛應用，相對經(jīng)典方法能縮短時(shí)間2天左右，且特異性高。
3.1.3 改良法： 熒光選擇性鑒別培養基法 該方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法。在營(yíng)養瓊脂基礎上添加4-甲基-傘形酮-α- D-葡萄糖苷(α-MUG)。阪崎腸桿菌在該培養基上形成黃色菌落，在紫外光照射下發(fā)生熒光。該法靈敏度和特異性都比較好，已在多個(gè)國家開(kāi)展使用，均取得穩定可靠的結果。
3.1. 4 改良法： 對硝基酚光電比色法 利用阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性，分解對硝基酚-α-D- 葡萄糖苷底物，釋放黃色的對硝基酚，在405 nm波長(cháng)下測定吸光度，根據吸光度的大小，確定樣品中阪崎腸桿菌是否存在。方法是常規增菌，在VRBG或TSA平板上挑取可疑菌落，制備成一定濃度的菌懸液與底物混勻，37℃ 4h后進(jìn)行比色測定。
3.1.5 陽(yáng)離子磁性珠快速捕獲法 MULLANCE等設計了革蘭陰性桿菌捕獲系統，能快速富集阪崎腸桿菌。他將普通珠子經(jīng)過(guò)順磁化后，使其表面帶有陽(yáng)離子(正電荷)，能極強地吸附帶有陰離子(負電荷)的物質(zhì)；革蘭陰性桿菌表面的脂多糖就是帶陰離子(負電荷)的物質(zhì)，故陽(yáng)離子磁性珠能捕獲含有脂多糖的革蘭氏陰性桿菌。MULLANCE將該系統設計成自動(dòng)化，即將嬰兒配方奶粉溶解后，通過(guò)管道輸送至捕獲器，反復與磁性珠接觸，使阪崎等革蘭陰性桿菌被吸附在磁性珠表面，然后在蛋白胨緩沖液中洗脫細菌；整個(gè)過(guò)程在6h內完成。然后將濃縮的菌液劃線(xiàn)，接種在選擇性顯色培養基(DFI) 或通過(guò)PCR分子生物學(xué)方法鑒定。使用該方法，最多在48h內鑒定出阪崎腸桿菌，比美國FDA經(jīng)典方法縮短5天左右，并且靈敏度很高，可檢出1～5CFU／500g 奶粉。
3.2 分子生物學(xué)方法
3.2.1 PCR方法 IVERSEN等利用16SDNA基因序列的PCR方法，對126株被API20E和ID32E自動(dòng)化鑒定為阪崎腸桿菌，其中有幾株是ATCC的標準菌株，進(jìn)行了核苷序列分析。發(fā)現阪崎腸桿菌與柯氏枸櫞酸桿菌最接近，有97．8％同源，而與陰溝腸桿菌只有97％同源； 利用16S DNA核苷序列分析，可將126株阪崎腸桿菌進(jìn)一步分為四個(gè)亞群：與標準菌株相比，有0.1％-1.2％序列不同的分為I群，共有110株；有1.6％-1.9％序列不同分為Ⅱ群，共有9株；有97.5％-97.8％同源分為Ⅲ群，包括分類(lèi)為Pyfinus腸桿菌、霍氏腸桿菌和柯氏枸櫞酸桿菌，共有5株；第 Ⅳ群僅2株，只有96.5％同源性。
LEHNER等則采用針對16S rRNA基因序列的PCR方法。他們對47株不同來(lái)源的阪崎腸桿菌和28株其他腸桿菌進(jìn)行了分析，經(jīng)與基因庫標準菌株對比，47株阪崎腸桿菌有99.4％-100％同源性，28株非阪崎腸桿菌則全部陰性,特異性很強，靈敏度可達10 pg。
MANOJ等設計了針對阪崎腸桿菌外膜蛋白A基因(OmpA)序列的PCR方法，所設計的產(chǎn)物能特異性地擴增阪崎腸桿菌的DNA片段，擴增產(chǎn)物為469bp 。OmpA基因是阪崎腸桿菌具有的獨特性位點(diǎn)，其他G腸道桿菌無(wú)此基因。因此，該PCR方法特異性非常高，檢測靈敏度在嬰兒配方奶粉直接檢測可達10CFU／ml，如通過(guò)8小時(shí)培養則可達103 CFU／ml，是一種理想的快速檢測阪崎腸桿菌的方法。
3.2.2 定量PCR方法 定量PCR是在一般PCR法基礎上發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)定量方法。目前國內外最常使用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real—time PCR )。最早使用該技術(shù)是上個(gè)世紀90年代美國PE公司開(kāi)發(fā)的Taqman熒光探針定量技術(shù)，稱(chēng)經(jīng)典方法。之后在此基礎上發(fā)展出了雜交探針?lè )�，以及熒光引物法等。熒光定�?SPAN lang=EN-US>PCR技術(shù)的基本原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，該基團是一對合適的熒光物質(zhì)，可以構成一個(gè)能量供體和能量受體對，其中供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜重疊，在PCR反應基因擴增時(shí)，激發(fā)供體而釋放的熒光能量正好被受體吸收，使得供體的熒光強度減弱而受體熒光強度增強，利用熒光信號強弱變化積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR反應過(guò)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已廣泛應用于多種食品微生物污染的檢測。SEO等利用阪崎腸桿菌部分大分子合成( MMS )操縱子基因序列建立了奶粉中阪崎腸桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能檢測到0.6g-1奶粉中的阪崎腸桿菌，且比傳統培養法檢測時(shí)間從 6～7天縮短至2天內完成。對68株阪崎腸桿菌和55株非阪崎菌進(jìn)行檢測，未出現假陽(yáng)性和假陰性，具有很好的特異性。
4 小結
阪崎腸桿菌主要通過(guò)嬰兒配方奶粉傳播能引起嚴重的新生兒疾患，死亡率高達50％以上，已引起了FAO／WHO及各國的高度重視。近幾年國內也有陸續報道，根據筆者搜索到有關(guān)阪崎腸桿菌的文獻資料，國內外報道最多的是食品安全問(wèn)題，臨床醫學(xué)界尚未引起足夠的重視，對阪崎腸桿菌對人體的致病因素、致病機理尚未深入研究；阪崎腸桿菌是條件致病 菌，在外界環(huán)境中的存在有較多研究，但對人體正常菌群中阪 崎腸桿菌的分布、阪崎腸桿菌的傳播、流行、耐藥等缺少相關(guān)資料。通過(guò)本文對阪崎腸桿菌的主要生物學(xué)性狀，致病因素，所致疾病、培養檢測方法等作了簡(jiǎn)要綜述，望能引起醫學(xué)界同仁的廣泛關(guān)注，起到拋磚引玉作用。
上一篇：阪崎腸桿菌生長(cháng)特性及耐熱耐酸堿性分析
下一篇：不同培養基對腸毒素大腸桿菌疫苗株產(chǎn)生菌毛的影響
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
