中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養基的設計優(yōu)化

  中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養基的設計優(yōu)化

田云龍 蔣細良。姬軍紅 朱昌雄  

摘要 ：目的  針對目前沒(méi)有適合中生菌素產(chǎn)生菌的合成培養基的現狀，進(jìn)行中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養基的設計，并對其進(jìn)行優(yōu)化，以期為以后中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵生產(chǎn)、營(yíng)養生長(cháng)、代謝、遺傳育種和產(chǎn)素機制的研究提供基礎。方法  順序通過(guò)無(wú)機氮源和有機氮源的篩選、正交試驗，并利用統計學(xué)軟件SPSS V13.0對實(shí)驗數據進(jìn)行分析，確定并優(yōu)化中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養基的組成成分。結果  最終確定了中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵合成培養基，該培養基在定量加入微量元素的基礎上，組成成分為谷氨酸鈉0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性淀粉1.5％，NH₄C1 0.3％，KH₂PO₄  0.02％，MgSO₄0.025％，NaC10.5％，CaCO₃ 0.3％。結論  經(jīng)過(guò)發(fā)酵驗證，該培養基的產(chǎn)素能力可達2000μg／mL左右，雖然比天然成分培養基低，但可以滿(mǎn)足以后營(yíng)養生長(cháng)、代謝、遺傳育種和產(chǎn)素機制等的研究。 

關(guān)鍵詞：   中生菌素；合成培養基；設計；優(yōu)化

中生菌素是新型的農用抗生素，它對革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌都有強烈的抑制或殺傷作用，對水稻白葉枯病、白菜軟腐病、蘋(píng)果輪紋病及蘋(píng)果葉斑病等有良好的防效。目前，中生菌素已在全國部分省市應用推廣，并取得了較大的經(jīng)濟效益。 

一直以來(lái)，中生菌素研究及發(fā)酵生產(chǎn)所用的培養基均為天然培養基(其中含有豆餅粉、玉米粉)，該類(lèi)培養基的成分復雜，碳源和氮源豐富，使用這種富營(yíng)養型培養基進(jìn)行發(fā)酵，效價(jià)較高，目前搖瓶效價(jià)可達5000μg／mL。但由于其中的豆餅粉和玉米粉成分復雜，不同產(chǎn)地、不同批次存在差異，影響了對實(shí)驗結果進(jìn)行定量和定性分析，合成培養基則可以彌補這個(gè)缺點(diǎn)。通過(guò)對合成培養組分的研究，確定影響發(fā)酵的主要因子，有利于優(yōu)化發(fā)酵培養基，推動(dòng)實(shí)際生產(chǎn)，也利于對發(fā)酵代謝機制的研究。

以不同的化學(xué)成分已知的氮源代替原培養基中的天然氮源，進(jìn)行中生菌素合成培養基成分的篩選優(yōu)化，比較發(fā)酵結果，選定合成培養基中所要采用的合成氮源；然后進(jìn)行正交實(shí)驗，利用統計學(xué)軟件SPSS Version 13.0對實(shí)驗數據進(jìn)行分析，最終確定了中生菌素產(chǎn)生菌的合成培養基的組成成分，為以后研究中生菌素產(chǎn)素菌營(yíng)養生長(cháng)、代謝、遺傳育種和產(chǎn)素機制提供了有力工具。

1   材料與方法

1.1 菌種

發(fā)酵所用菌種為淡紫灰鏈霉菌海南變種(Streptomyces  lavendulae var．hainanensisn ) UV -69突變株，由中國農業(yè)科學(xué)院農業(yè)環(huán)境與可持續發(fā)展研究所保存。 

1.2 培養基

淀粉培養基：可溶性淀粉10g、KH₂PO₄  1g、MgSO₄   0.5 g、NaNO₃  2g、KC1  0.5g，FeSO₄   0.01g，瓊脂l5.20g，用1000mL開(kāi)水順序加入，自然pH值。 

微量元素：每1000mL合成培養基中加入0.017mg(NH₄) ₆Mo₇O₂₄•4 H₂O，0.026mg   H₃BO₃， 0.18mg CuSO₄•7H₂O， 4mg ZnSO₄•7H₂O，1mg FeSO₄， 10 mg MnCl₂•4H₂O 。 

1.3 培養方法

斜面菌種的培養：用接種環(huán)從保存的斜面菌種中刮取淡紫灰鏈霉菌海南變種的孢子，轉接到新鮮的淀粉斜面培養基中，培養箱中，28℃培養5—7d。

茄子瓶種子的培養：用接種環(huán)從試管斜面菌種中刮取菌種，轉接到新鮮的茄子瓶淀粉培養基中，培養箱中，28℃培養5-7d 。 

搖瓶發(fā)酵：從培養好的茄子瓶菌種斜面中挖取小菌塊轉移到搖瓶中，然后在200r／min，29℃條件下培養64h 。 

1.4 效價(jià)測定

采用管碟法測定生物效價(jià)，以枯草芽孢桿菌(Bacillus  subtilis)作為指示菌。 

1.5 合成培養基的篩選優(yōu)化方法

采用正交實(shí)驗法對合成培養基的組成進(jìn)行優(yōu)化。試驗采用L27 (3¹³) 正交表，表頭設計及因素水平設置見(jiàn)表1和表2 。整個(gè)試驗共27個(gè)處理，每個(gè)處理設置2個(gè)重復。 

表1 正交實(shí)驗表頭設計

Tab．1   Design  of   orthogonal  test  by  L27 (3¹³ ) matrix

表2 正交實(shí)驗因素及水平

Ta b．2   Factors  and  levels  assigned  in  the  L27 (3¹³ )orthogonal  matrix 

1.6 數據的統計處理

使用SPSS13.0軟件對實(shí)驗數據進(jìn)行統計分析。 

2 結果與分析

2.1 合成培養基中氮源的篩選

選取谷氨酸鈉、脲、NH₄Cl作為氮源，再加以不同組合，各設置4次重復分別進(jìn)行發(fā)酵，結果見(jiàn)表3。 從表3可以看出，谷氨酸鈉與NH₄C1 組合作為氮源發(fā)酵效價(jià)較高，分別比其它幾種氮源高38.78％，30.77％，54.55％，67.49％，9.67％，因此選定其作為合成培養基的氮源。

 表3 氮源篩選實(shí)驗結果

表4 正交試驗結果

2.2 合成培養基的篩選

利用正交實(shí)驗方法5 種主要營(yíng)養成分谷氨酸鈉(A)、葡萄糖(B)、淀粉(C)、NH₄Cl (D)、KH₂PO₄ (E) 進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗結果見(jiàn)表4。 

利用SPSS  Version  13.0 統計軟件對正交試驗結果進(jìn)行方差分析和多重比較。分析結果見(jiàn)表5 和表6 。

表5 方差分析表

R²=0.896(調整R²=0.810)

由表5可知，校正后的總體模型在α=0.01的水平上F檢驗達到了極顯著(zhù)，總體模型擬合得很好，因此可進(jìn)一步對各個(gè)因素進(jìn)行方差分析，確定各個(gè)因素對效價(jià)影響作用的大小。由方差分析表可知，5個(gè)因素對中生菌素的發(fā)酵效價(jià)都有極顯著(zhù)影響，其影響次序依次為KH₂PO₄ >葡萄糖>氯化銨>谷氨酸鈉>可溶性淀粉。4對互作效應中，除葡萄糖與NH₄C1的互作對發(fā)酵效價(jià)無(wú)顯著(zhù)影響之外，其它3對互作都有顯著(zhù)影響，其次序依次為葡萄糖×KH₂PO₄>谷氨酸鈉×葡萄糖>谷氨酸鈉×KH₂PO₄。 

對表6進(jìn)行分析并結合多重比較的結果(在此沒(méi)表3氮源篩選實(shí)驗結果有列出)可知，5個(gè)因素的最佳組合為：谷氨酸鈉選擇水平l，葡萄糖選擇水平2，KH₂PO4選擇水平1，NH₄C1選擇水平l，可溶性淀粉選擇水平3 ，即合成培養基配方為谷氨酸鈉0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性淀粉1.5％，NH₄C1 0.3％，KH₂PO₄   0.02 ％，Mg SO₄   0.025％， NaCl  0.5％，CaCO₃  0.3％，再加入微量元素。 

2.3合成培養基中中生菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵效價(jià)

為驗證篩選得到的合成培養基發(fā)酵產(chǎn)中生菌素的能力，對正交試驗中發(fā)酵效價(jià)較高的處理、篩選得到的培養基進(jìn)行發(fā)酵對比，結果如表7 。 

表7 合成培養基驗證試驗結果

由表7可看出，優(yōu)化得到的合成培養基的產(chǎn)素能力明顯高于正交試驗中發(fā)酵效價(jià)較高的6個(gè)處理，分別比4、13和25號處理高38.17％、45.31％和40.22％，可用于進(jìn)一步的中生菌素產(chǎn)生菌生理生化特性研究。 

3 討論

進(jìn)行正交試驗時(shí)，處理4和13的發(fā)酵效價(jià)均達2000單位，而在驗證試驗時(shí)卻只有1200個(gè)單位左右，2次實(shí)驗間的重復性不好。這可能是由于搖瓶實(shí)驗的影響因素眾多，每批實(shí)驗條件都不可能做到完全一致。如：一批配制的培養基，而且在同一搖床、同一恒溫間培養，等到放瓶時(shí)結果就有差別，而批次之間的差異更難控制。因此，在實(shí)驗過(guò)程中，就需要嚴格控制實(shí)驗條件。比如，培養基必須是同一批配制的；接種量保持均勻一致，將種子液盡量混勻后再接種；種子液的年齡和濁度要保持批次之間的一致性等。 

目前，在中生菌素產(chǎn)生菌分類(lèi)鑒定、有效成分鑒別、抗菌活性、毒理測定、作用機制、發(fā)酵生產(chǎn)、劑型創(chuàng )制、田間推廣應用等方面取得了很大進(jìn)步，但有關(guān)中生菌素生物合成過(guò)程中該菌的產(chǎn)素機制、生理學(xué)及遺傳學(xué)研究尚少，在這些領(lǐng)域研究進(jìn)展緩慢的原因之一就是使用天然培養基，其中成分的復雜性妨礙了對實(shí)驗結果的正確分析和判斷。本文開(kāi)發(fā)出的合成培養基的發(fā)酵效價(jià)雖然與天然成分培養基有較大差距，但是合成培養基容易控制已知成分，確保了對實(shí)驗結果進(jìn)行比較準確和可靠地分析，在中生菌素的生產(chǎn)和理論研究中都具有一定意義，可以彌補天然成分培養基成分易變，實(shí)驗結果分析困難的缺點(diǎn)。 

參考文獻 ：略

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