耶爾森氏菌檢驗

　　1981年根據DNA以及生化和形態(tài)特征的相關(guān)資料，與小腸結腸炎耶爾森氏菌極為密切3個(gè)同源群被作為耶爾森氏菌的新種命名，它們是弗氏耶爾森氏菌（Y·frederiksenii）、中間型耶爾森氏菌（Y·intermedia）和克氏耶爾森氏菌（Y·krislensenii）。

一、生物學(xué)特性

1、形態(tài)特性

　　本菌為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，大小為1-3.5×0.5-1.3μm，多單個(gè)散在，有時(shí)排列成短鏈或成堆。本菌不形成芽胞，無(wú)莢膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30℃以下培養條件形成，溫度較高時(shí)即喪失，因此表現為30℃以下有動(dòng)力，而35℃以上則無(wú)動(dòng)力。

2、培養特性

　　本菌生長(cháng)溫度為30-37℃，但在22-29℃才能使本菌的某些特性出現。4℃時(shí)能保存和繁殖。本菌世代時(shí)間長(cháng)，最短亦需40分鐘左右。在SS或麥康凱瓊脂上于25℃經(jīng)24小時(shí)培養，菌落細小，至48小時(shí)直徑才增大成0.5-3.0mm。菌落圓整、光滑、濕潤、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麥康凱瓊脂上菌落淡黃色，如若微帶紅色，則菌落中心的紅色常稍深。本菌在肉湯中生長(cháng)呈均勻混濁，一般不形成菌膜。

3、生化特性

表一：本菌的生化特性及其與近緣菌的鑒別

4、生物型

　　小腸結腸炎耶爾森氏菌的生物型分類(lèi)方法有幾種，目前FDA細菌分析手冊第八版中采用的是Wanters 1981的分型方法。

表二：小腸結腸炎耶爾森氏菌的生物型

注：( ) 表示遲緩反應

V 表示可變反應

C 在日本發(fā)現血清型為0:3的生物型

5、血清型

　　小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株根據其耐熱性和耐受高壓滅菌的菌體抗原能被血清學(xué)分型。Wanters將小腸結腸炎耶爾森氏菌和相關(guān)菌歸納為54個(gè)血清群，Aleksii和Bockemuh等人提議將小腸耶氏菌的血清群簡(jiǎn)化為18個(gè)群。目前下列血清群的致病菌株已通過(guò)鑒定，它們是0:1,2a,3；0:2a,3；0:3；0:8；0:9；0:4,32；0:5,27；0:12,25；0:13a,13b;0:19；0:20；0:21。引起人類(lèi)疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。

二、流行病學(xué)

1、細菌分布

　　小腸結腸炎耶爾森氏菌分布很廣，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉類(lèi)、豆制品、沙拉、牡蠣、哈和蝦。也存在于環(huán)境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已從家畜、狗、貓、山羊、灰鼠、水貂和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的糞便中分離出該菌。在港灣周?chē)�，許多鳥(niǎo)類(lèi)包括水禽和海鷗可能是帶菌者。

　　豬的帶菌率較高，日本報告檢出率為4%，加拿大為3.6%，丹麥為10-17%。在豬中，該菌最易在扁桃腺中發(fā)現。

2、流行情況

　　確定耶爾森氏菌作為一種食源性疾病的有關(guān)特性了解較多，其在世界范圍內已爆發(fā)多起，食品和飲水受到污染，往往是爆發(fā)胃腸炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地區暴發(fā)過(guò)兩起，有138名兒童感染，源于攝入生牛奶。1976年在美國紐約爆發(fā)過(guò)一起，有217名學(xué)生感染，在這起發(fā)病過(guò)程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年發(fā)生于華盛頓的一起有87人感染，污染源是用未經(jīng)氯處理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃腸炎或中毒爆發(fā)，在歐洲以冬春季節較多，夏季較少，而日本則以夏季發(fā)病率較高。在我國福建省南部地區，該菌是冬春季腹瀉的重要病原菌，根據陳元川案（1984）于不同季節對豬帶菌動(dòng)態(tài)的調查，發(fā)現兩個(gè)養豬場(chǎng)僅在冬春兩季有該菌檢出，檢出的菌株均為O3血清型。

3、臨床癥狀

　　小腸結腸炎耶爾森氏菌是30年代引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病原菌，為人畜共患病。潛伏期約攝食后3-7天，也有報導11天才發(fā)病。病程一般為1-3天，但有些病例持續5-14天或更長(cháng)。主要癥狀表現為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、嘔吐、關(guān)節炎、敗血癥等。耶爾森氏菌病典型癥狀常為胃腸炎癥狀、發(fā)熱、亦可引起闌尾炎。有的引起反應性關(guān)節炎，另一個(gè)并發(fā)癥是敗血癥，即血液系統感染，盡管較少見(jiàn)，但死亡率較高。

　　本菌對易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。

三、致病性

1、腸毒素

　　該菌能產(chǎn)生耐熱性腸毒素，（分子量為10000-50000），能耐熱121℃30分鐘，能在4℃保存7個(gè)月，pH1-11中穩定。但腸毒素的產(chǎn)生僅限于22-25℃。血清型03、08和09幾乎經(jīng)常產(chǎn)生腸毒素，在其他血清型中也有產(chǎn)生腸毒素的菌株。該腸毒素被攝入即可引起發(fā)病。

2、侵襲性

　　Hela細胞感染，血清型O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21和O22都能侵入Hela細胞，鑒于Hela細胞感染陽(yáng)性株多是人類(lèi)致病的常見(jiàn)血清型，以及從人和動(dòng)物死亡所見(jiàn)腸類(lèi)的侵入模型，表明Hela細胞侵入性在小腸結腸炎耶爾森氏菌腹瀉的發(fā)病機理上是重要的。

　　Sereny試驗，有人將11株小腸結腸炎耶爾森氏菌的菌懸液接種于豚鼠眼結膜，有6株引起嚴重的角膜結膜炎，即Sereny試驗陽(yáng)性。這6株均為O8血清型。

3、自凝性。

　　1980年Laird等人提出了一種測定本菌毒力的簡(jiǎn)易方法，即將試驗菌接種于二管含10%小牛血清的組織培養液內，分別置22℃和36+1℃培養，若22℃培養，菌液混濁，而37℃培養，細菌凝結，上層液體透明，即為有毒力的菌株，稱(chēng)為自凝陽(yáng)性。在檢查的180株菌中有25株陽(yáng)性，這些陽(yáng)性菌株均能引起腹瀉。

4、VW抗原

　　已知該菌的某些菌株具有與鼠疫耶爾森氏菌和假結核耶爾森氏菌在免疫學(xué)上相同的VW抗原。其在37℃生長(cháng)時(shí)需要鈣而在25℃生長(cháng)時(shí)不需要鈣的菌株即含VW抗原。Karmali等人將從病人糞便檢出的O21血清型自凝陽(yáng)性的菌株，在草酸鎂瓊脂上于35℃培養不生長(cháng)，用于口服小鼠則產(chǎn)生腹瀉�？梢�(jiàn)自凝陽(yáng)性與缺鈣培養基上35℃無(wú)生長(cháng)能力是一致的，能使小鼠發(fā)生腹瀉。

5、毒性質(zhì)粒。

　　耶氏菌病和小腸結腸炎耶爾森氏菌帶有41-48Mdal的質(zhì)粒有關(guān)。這被認為是毒性質(zhì)粒，即與毒力有關(guān)的質(zhì)粒。有人將失去毒性質(zhì)粒的O8、O3和O9型菌株用小鼠作喂飼試驗，均不發(fā)病，但用帶毒性質(zhì)粒的O8和O3型菌株試驗時(shí)，小鼠則均發(fā)生腹瀉或死亡。且菌株自凝試驗的結果與毒性質(zhì)粒的存在與否相一致。

四、檢驗與控制

A、增菌

　　1、無(wú)菌稱(chēng)取25.0g樣品于225mL，蛋白胨山梨醇膽汁肉湯（PSBB）中，均質(zhì)30秒，置10℃培養10天。

　　2、如果懷疑產(chǎn)品為高含量耶氏菌，在肉湯培養前各取0.1mL劃線(xiàn)于麥康凱瓊脂和cefsulodin;irgasan;新生霉素(CIN)瓊脂。然后取1mL均質(zhì)液至9mL 0.5%鹽水(含0.5%KOH)中，混合數秒鐘，各取0.1mL 劃線(xiàn)麥康凱和CIN瓊脂平板。將平板置30℃培養1天，把平板上生長(cháng)的菌落轉移到Whatmam541濾紙上，用于DNA克隆雜交技術(shù)直接檢測耶氏菌的致病基因。如果耶氏菌含量較低，省去這一步。

　　3、將經(jīng)10天培養的增菌肉湯充分混合，轉移0.1mL至1mL 0.5%鹽水（含0.5%KOH）中，混合5-10秒。連續劃線(xiàn)于麥康凱平板和CIN平板。另取0.1mL增菌液至1mL 0.5%鹽水中，如上在劃線(xiàn)前混合5-10秒。置平板于30℃培養1天。

B、細菌分離。

　　檢查經(jīng)1天培養的麥康凱平板，排除紅色或粘液狀菌落，挑取小的（直徑1-2mm），偏平，無(wú)色的或淡粉紅色菌落。同時(shí)檢查CIN平板，挑取具有緊紅色中心整個(gè)邊緣明顯無(wú)色的小菌落（直徑1-2mm）。用接種針將所選菌落穿刺接種于賴(lài)氨酸精氨酸鐵瓊脂（LAIA）斜面。Christensen;s尿素瓊脂平板或斜面。膽汁七葉甙瓊脂平板或斜面。室溫培養48小時(shí)。在LAIA中的培養物會(huì )產(chǎn)生鹼性斜面，酸性底層，不產(chǎn)生氣體和H2S（KA--）的反應，被認為是尿素酶陽(yáng)性的可疑耶氏菌。去除在LAIA中產(chǎn)H2S或產(chǎn)氣或尿素酶陰性的培養物。

C、鑒定

　　將LAIA斜面上的培養物劃線(xiàn)接種于厭氧卵黃瓊脂（AEY），置室溫培養。使用AEY上的生長(cháng)物進(jìn)行純度檢查、脂肪酶反應（2-5天）氧化酶試驗、革蘭氏染色、和生化試驗的接種。將AEY上的菌落接種于生化試驗培養基，置室溫培養3天（動(dòng)力試驗培養基和MR-VP肉湯在35-37℃培養1天）。

D、解釋

　　耶爾森氏菌為氧化酶陰性、革蘭氏陰性的桿菌，表1和表2可用于鑒定耶氏菌的菌株和生物型。目前已知小腸結腸炎耶爾森氏菌生物型為1B、2、3、4、5具有致病性，這些生物型和第6生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七葉甙和發(fā)酵水楊甙。生物型6和克氏耶氏菌相當少，可以通過(guò)微弱發(fā)酵蔗糖加以區別，并且吡嗪酰胺酶均為陽(yáng)性反應。對于生物型1B、2、3、4、5的小腸結腸炎耶氏菌可進(jìn)一步進(jìn)行致病性測試。

　　耶爾森氏菌為兼性厭氧菌，生長(cháng)溫度為-1 ～48℃，能在反復冷凍，緩化下存活。由于該菌可在4℃下進(jìn)行冷增菌，因此保存在4-5℃冰箱中的食品具有污染的危險。該菌要求較高的水活度，最低水活度為0.95，pH接近中性，較低的耐鹽性。對加熱、消毒劑敏感。

　　控制耶爾森氏菌的關(guān)鍵因素包括適當的蒸煮或巴氏滅菌，適宜的食品處理以防止二次污染。進(jìn)行水處理、合理使用消毒劑等控制措施。

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