亞硫酸鹽還原菌及檢測

一、生物學(xué)特性與衛生學(xué)意義
    亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細菌，而不是一個(gè)生物學(xué)分類(lèi)單位。多指厭氧芽胞桿菌，代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌，其他常見(jiàn)的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。此類(lèi)細菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物，多為有動(dòng)力的革蘭氏陽(yáng)性菌，可形成芽胞，厭氧生長(cháng)。
    厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在，通常出現在人和動(dòng)物的糞便排泄物，廢水和土壤中。與大腸桿菌和其它桿菌不同的是，由于它們的孢子比營(yíng)養體對物理和化學(xué)因子具有更強的抵抗力，所以可以在自然環(huán)境中存活很大時(shí)間。因而，通常將他們作為長(cháng)期污染或間斷污染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度，因此，它們對判斷是否已達到控制目的非常有用。
    由于此類(lèi)細菌抵抗力強，即使在經(jīng)適當加工處理的加工食品中其芽胞仍會(huì )存活，條件適宜時(shí)又會(huì )生長(cháng)繁殖，造成食品品質(zhì)降低或腐敗，甚至會(huì )引起食物中毒的危險。因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠(chǎng)環(huán)境衛生控制上頗受重視，作為食品、礦泉水、加工設備衛生、生產(chǎn)環(huán)境的衛生狀況的評估指標，正確得到越來(lái)越廣泛的應用。
    該類(lèi)細菌的檢測多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評估，在九十年代中后期開(kāi)始在食品衛生領(lǐng)域中有所要求，但多局限于歐洲國家和地區，如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國。到目前為止，該菌一般不被作為食品衛生常規檢測項目和致病菌檢測內容，我國和美國未將該檢測項目列入食品微生物檢測項目和要求中。
    二、檢測方法
    由于此類(lèi)細菌以形成芽胞、厭氧生長(cháng)和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征，往往無(wú)需作進(jìn)一步實(shí)驗驗證，因此在檢測中將滿(mǎn)足以上三個(gè)條件的一群細菌全部認定為厭氧亞硫酸鹽還原菌。
    檢測方法一般包括以下三部分：檢樣在接種前在80-100℃水浴中處理10-15分鐘，以殺滅抵抗力弱的芽胞細菌的營(yíng)養體，同時(shí)刺激芽胞的繁殖；通過(guò)選擇性培養如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力，如果有則進(jìn)一步與培養基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應，使菌落呈現黑色；培養基接種后置于厭氧環(huán)境中培養確認厭氧特征。也可在培養基中加入抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽還原菌的生長(cháng)。
    下面詳細介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗方法。
    1.培養基和試劑
    1.1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液
    1.2 亞硫酸鐵瓊脂
    1.3 過(guò)氧化氫試劑
    2.儀器和設備
    2.1 均質(zhì)器:用于處理固體樣品
    2.2培養罐（箱）,帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設備或試劑
    2.3 恒溫培養箱:37±1℃或46±1℃
    2.4 振蕩器
    2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度
    2.6 培養皿:直徑為90mm
    2.7 稀釋瓶:容量為500mL和250mL的廣口瓶
    2.8 天平:感量0.1g
    3.抽樣和試樣制備
    3.1 抽樣
    參照SN0330-94規定抽樣
    3.2試樣制備
    無(wú)菌操作稱(chēng)取剪碎后的樣品25g,置于裝有225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中。若檢測亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min熱處理樣品,之后以流水迅速冷卻至室溫后再稱(chēng)取。充分混勻后據樣品污染情況做進(jìn)一步的系列十倍梯度稀釋。
    4.檢驗步驟與計數
    4.1菌落計數法
    適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計數>10g(mL)的食品。
    4.1.1接種和培養
    4.1.1.1對每一份試樣，選用適宜的三個(gè)連續稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1 mL，一式雙份地接種于每個(gè)滅菌的培養皿中。
    4.1.1.2 傾注約15 mL制備好的并于水浴箱保溫至45℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備最初稀釋液結束到傾注培養基于最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不應超過(guò)15min。仔細將接種物和培養基充分混勻，水平放置，使其凝固。
    4.1.1.3待混合物凝固后，在傾注10 mL同樣的培養基于已凝固的培養基上作為隔層以防氧吸附，并防止細菌蔓延生長(cháng)。
    4.1.1.4 待該隔層凝固后反轉制備好的平板，于37±1℃厭氧培養24-48h。若對培養溫度有特殊要求（如46℃），可依據情況進(jìn)行培養。
    4.1.2計數
    4.1.2.1亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厭氧培養24h后，計數典型的菌落；若平板上無(wú)特征性菌落或菌落較�。�<0.5mm），則需繼續培養24h再計數；若48 h后的菌落增大以至相連，則以24 h的計數為準，反之則以48h為準。
    那些僅產(chǎn)生氫（而不是H2S）的厭氧菌生長(cháng)時(shí)也可還原亞硫酸鹽而導致培養基出現彌散的、非典型的普遍變黑，這種現象不應計數。
    4.1.2.2取特征性菌落（不少于5個(gè)）移種于皰肉培養基中，37±1℃厭氧培養24-72 h。待出現生長(cháng)特征（培養液渾濁、產(chǎn)氣、出現異味）后，按5條進(jìn)行證實(shí)試驗。對陽(yáng)性結果進(jìn)行計數。
    4.1.2.3讀取帶有10-100個(gè)黑色菌落的平皿，結果以相應稀釋度的兩個(gè)平板的菌落數平均值乘以相應稀釋倍數來(lái)計算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數。結果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數/g(mL)。
    若相應測試試樣的兩個(gè)平板上均無(wú)特征性菌落，以<10/g(mL)報告
    4.2最近似值（MPN）法
    適用于檢查亞硫酸鹽還原梭菌計數≤10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品。
    4.2.1接種和培養
    4.2.1.1增菌
    選用適宜的三個(gè)連續稀釋的樣液，從每個(gè)樣液中分別吸取1mL，一式三份地接種于3管裝有皰肉培養基的試管中,接種后上面覆蓋一層無(wú)菌的液體石蠟，37±1℃培養24-72h。待出現生長(cháng)特征（培養液混濁、產(chǎn)氣、出現異味）后,按5.1條進(jìn)行鏡檢。反之，則報告陰性。
    4.2.1.2分離培養
    取4.2.1.1增菌培養物1mL置于滅菌的培養皿中，傾注約15mL45℃的亞硫酸鐵瓊脂。仔細將接種物和培養基充分混勻，待其凝固后，再傾注10mL同樣的培養基作為隔層，于37±1℃厭氧培養24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5條加以證實(shí)；反之，則報告陰性。
    4.2.2結果計算
    4.2.2.1計數每個(gè)稀釋度得到的陽(yáng)性反應管數。
    4.2.2.2利用MPN表，由陽(yáng)性管數估算每克（毫升）試樣中亞硫酸鹽還原梭菌最近似值。結果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數/g(mL)。
    5.證實(shí)試驗
    5.1形態(tài)觀(guān)察
    取皰肉培養物涂片，鏡檢，作革蘭氏染色，檢查培養物細菌形態(tài)。亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，單個(gè)散在，成對、成小鏈狀或并列地聚堆存在。產(chǎn)芽胞時(shí)，芽胞呈卵圓形或球形，位于中央、次終端或終端。
    5.2過(guò)氧化氫酶試驗
    在潔凈載玻片上滴1滴培養物，再滴加1-2 滴3% 的過(guò)氧化氫。
    出現小氣泡說(shuō)明有過(guò)氧化氫酶活性。
    亞硫酸鹽還原梭菌不形成過(guò)氧化氫酶。
    附錄：
    A1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液
    將8.5g氯化鈉和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸餾水中。調節pH至7.2±0.1。分裝225 mL于250 mL廣口瓶中，121℃高壓滅菌15min。
    A2 亞硫酸鐵瓊脂
    胰蛋白胨 15.0g
    大豆蛋白胨 5.0g
    酵母浸膏 5.0g
    偏重亞硫酸鈉 1.0g
    檸檬酸鐵銨 1.0g
    瓊脂 20.0g
    蒸餾水 1000g
    將各成分混勻，加熱溶解，調節pH至7.6±0.1，分裝于500 mL錐形瓶中各250 mL，121℃高壓滅菌15 min。一周內用完。
    A3皰肉培養基
    牛肉浸液 1000 mL
    蛋白胨 30.0g
    酵母浸膏 5.0g
    磷酸二氫鈉 5.0g
    葡萄糖 3.0g
    可溶性淀粉 2.0g
    碎肉渣 適量
    取碎肉渣分裝15mm×150mm試管約2-3cm高，將上述液體培養基分裝至每管內超過(guò)肉渣表面約1 cm。121℃高壓滅菌15 min。
    A4 過(guò)氧化氫酶試驗
    挑取培養物一接種環(huán)，置于潔凈載玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫溶液（臨用時(shí)配制）2mL，于半分鐘內觀(guān)察發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性，不發(fā)生氣泡者為陰性。

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