MTT法進(jìn)行活菌計數的方法學(xué)探討

目的：建立一種快速、穩定、靈敏并可反映細菌活性的細菌計數方法。

方法：以大腸桿菌為研究對象,探討MTT法用于細菌計數的可行性及反應時(shí)間、測量細菌數量的范圍、MTT的用量、是否加入溶解劑等實(shí)驗條件。

結果：細菌數在3. 8×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 范圍內測出的OD值與細菌濃度呈良好的正相關(guān) ,反應時(shí)間為20分鐘,MTT 10μl、 20μl 均可,20μl 效果更佳�？刹挥萌芙鈩�。

結論：MTT比色分析法可用于檢測活菌數量。

關(guān)鍵詞 　 MTT比色法;活菌計數;方法學(xué)

　　 在微生物學(xué)、免疫學(xué)以及其他學(xué)科的實(shí)驗中,常用一定濃度的活菌作為實(shí)驗材料,這就涉及到一個(gè)活菌計數的問(wèn)題。微生物學(xué)用于細菌計數的常規方法有比濁法、分光光度計測定法、 平板傾注法或平板涂布法等。前兩種操作方法簡(jiǎn)單,但只能測量細菌數量,不能判斷細菌的活性;后兩種雖然測量的是活菌數,但方法繁瑣,重復性較差,所需時(shí)間長(cháng)。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創(chuàng ),其原理是活細胞內的線(xiàn)粒體脫氫酶可將MTT(為一種淡黃色的四甲基偶氮唑鹽)還原成藍紫色甲月替,而且形成的量與活細胞數量成正比關(guān)系。此方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩定之特點(diǎn),克服了常規方法的不足之處。MTT法目前大多用于免疫細胞及其他細胞的活性檢測,未見(jiàn)用于細菌等微生物的活性檢測的報道。本實(shí)驗以大腸桿菌為研究對象,對MTT法用于測量活菌數的可行性及實(shí)驗條件進(jìn)行了探討。

1 　 材料和方法

1. 1 　 細菌

將大腸桿菌的標準菌株(埃希氏菌 44664 ,購于中國藥品生物制品鑒定所)培養于肉湯管,放37 ℃恒溫箱孵育18～24小時(shí),用比濁法定量后,倍比稀釋成8種濃度。

1. 2 　試劑

MTT(sigma)溶于pH7. 4   PBS ,濃度 5mg/ml ,過(guò)濾除菌,4℃ 冰箱避光保存。二甲基亞砜(DMSO) 。

1. 3 　MTT比色法測定

取不同濃度的大腸桿菌肉湯培養物 ,加入 96 孔平底培養板(美國Nunc) ,每孔100μl ,各做5個(gè)復孔 ,按10μl/孔或20μl/孔加入 MTT溶液 ,放37 ℃恒溫箱10分鐘,20分鐘,40 分鐘后取出,加或不加 DMSO ,用全自動(dòng)酶標儀(Bio - Rad450 型)于波長(cháng)570nm下測定OD值。

2 　 結果與分析

2. 1 　 測量范圍

甲月替是活細胞代謝的產(chǎn)物 ,由圖1可見(jiàn),其生成量隨活菌數的增多而增加,細菌數在3.8 ×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 范圍內與OD 值成正相關(guān) ,線(xiàn)性良好 ,其相關(guān)系數 r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 2 　MTT的量對結果的影響　　 分別在細菌數相同的孔中加入 MTT(5mg/ ml )10μl 或20μl ,反應后測OD值 ,結果如圖2所示,各孔OD值隨MTT的量增加而有所增加,在測量范圍內 ,細菌數與 OD 值均呈正相關(guān) ,但加入的 MTT 量為20μl 時(shí) ,相關(guān)性更好。MTT量為 10μl , r = 0. 9749 , P< 0. 01 ;MTT量為20μl ,  r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 3 　 反應時(shí)間對結果的影響

在孔中加入MTT后 ,用肉眼可觀(guān)察到濃度高的兩孔(1.2×10⁹/ml 和 6×10⁸/ ml)幾乎立即出現均勻的藍紫色,放37 ℃ 孵箱 10 分鐘后取出 ,發(fā)現除前兩孔外,后幾孔無(wú)明顯變化 ,繼續放孵箱 20 分鐘、 40分鐘后取出測 OD 值 ,反應 20 分鐘 ,各孔的OD 值已有明顯的梯度變化 ,OD 值與細菌數之間的相關(guān)系數 r = 0. 9998 , P < 0. 01 ;反應 40分鐘后 ,測出的 OD 值稍有增加 ,OD 值與細菌數之間的相關(guān)系數反而降低( r = 0. 9735) 。實(shí)際測定中 ,反應20分鐘即可。

2. 4 　 溶解劑對結果的影響

反應時(shí)間終止時(shí) ,肉眼觀(guān)察各孔中呈現深淺不同但很均勻的藍紫色 ,倒置顯微鏡(40×)下觀(guān)察 ,有大團分布均勻的藍紫色顆粒,加入DMSO后 ,觀(guān)察到顆粒變小、變少,但OD 值的測量加入DMSO前后OD值無(wú)顯著(zhù)差異。

3 　 討論

活細胞體內的線(xiàn)粒體脫氫酶將淡黃色的MTT代謝后形成藍紫色的甲月替,該物質(zhì)在 560～610nm中有一個(gè)較寬的最大吸收峰,用酶標儀可對其進(jìn)行直接測量,其值與活細胞的數量有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

本實(shí)驗對使用酶標儀測定活菌數量的 MTT法進(jìn)行了探索 ,實(shí)驗結果表明: ①細菌濃度在 3. 8×10⁷～1. 2 × 10⁹/ ml時(shí),OD值與活菌數呈良好的正相關(guān)。此測定范圍完全可滿(mǎn)足一般檢測的需要。② MTT的量用10μl 或 20μl 均可,但 MTT為 20μl 時(shí) ,OD 值與活菌數間的相關(guān)性更好。③ 反應時(shí)間為20分鐘時(shí) ,OD值與細菌濃度呈良好的正相關(guān) ,延長(cháng)反應時(shí)間 ,OD 值與細菌濃度間的相關(guān)性反而下降。④加入MTT后 ,用肉眼及倒置顯微鏡觀(guān)察 ,孔中呈現均勻的藍紫色 ,測 OD 值也表明,加入DMSO 前后,結果沒(méi)有顯著(zhù)差異,提示測量活菌數可不用溶解劑。這點(diǎn)和報道的檢測其他細胞活性的 MTT比色法有所不同,可能與原核細胞和真核細胞代謝特點(diǎn)的差異以及反應時(shí)間不同有關(guān) ,有待進(jìn)一步探討。

綜上所述,我們認為 MTT比色分析法可用于測量活菌數量,較好的實(shí)驗條件為每孔加 MTT (5mg/ml ) 20 μl ,37 ℃ 孵育20 分鐘 ,可不加溶解劑,在 570nm波長(cháng)測定OD 值。此法經(jīng)濟、簡(jiǎn)便、快速、穩定、靈敏度高,且測出的為活菌數量,具有傳統細菌計數法所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn) ,可滿(mǎn)足一般臨床及基礎檢測的需要。

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