SPA的提取

1.煮沸提取法

     ⑴ 將菌株接種于蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基上，37℃培養20h~24h。
　　⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液將菌苔洗下，配成10%（V/V）的懸液。
　　⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷卻至4℃，4000r/min離心20min，去沉淀。
　　⑷ 以1mol/LHCl將上清液調pH至3.0~3.5，然后4000r/min離心30min。
　　⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min離心20min。
　　⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，4000r/min離心20min。
　　⑺ 沉淀（可直接凍干為粗提SPA制品）加PH7.4PBS液溶解，12000r/min離心20min。
　　⑻ 上清液即為粗提SPA液。
　　⑼ Sephadex G100過(guò)柱，上樣后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脫，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。
　　⑽ 測OD275nm值及用對流免疫電泳檢測每管的活性，將有活性的各管合并、濃縮或凍干。

2.溶菌酶消化法

⑴ 將培養的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液配成10%~15%的懸液。
　　⑵ 按20：1（W/W）的量加入SPA菌液與溶菌酶（活力為1萬(wàn)U/mg蛋白）37℃水溶攪拌24h。
　　⑶ 置4℃冷卻后，以12000g離心30min。
　　⑷ 取上清，調pH值至7.0。
　　⑸ 加硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液呈80%的飽和度，4℃過(guò)夜。
　　⑹ 12000g離心30min。
　　⑺ 以少量蒸餾水將沉淀溶解。
　　⑻ 透析或過(guò)Sephadex G50除鹽，即為粗制的SPA制品。

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