病毒RNA傳統提取方法

1、單層細胞的裂解

a）吸出培養液，以7ml用冰預冷的無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤(pán)上。

b）直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液，并使之遍布整個(gè)平板的表面。（RNA提取緩沖注液配方：0.14mol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)，0.5％NP-40，1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），100單位/ml RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物。）

c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。（蛋白酶消化緩沖液配方：0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)，25mmol/L EDTA(pH8.0)，0.3mol/L NaCl，2％ SDS）

d）用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。

e）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml蛋白K溶液。

2、懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解

a）于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其徹底分散。

b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。

c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。

d）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。

二、提取步驟

1、用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。

2、用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個(gè)新的離心管內，加2.5倍體積用冰乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時(shí)。

3、于4℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動(dòng)微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。

4、每個(gè)直徑為90mm的培養皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl(pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。

5、分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤(pán)RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。

6、加入無(wú)RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。

7、分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。

8、用等體積酚：氯仿抽提1次。

9、于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個(gè)離心管內，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時(shí)。

10、用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。

11、吸出所有的乙醇，將打開(kāi)管蓋的離心管在實(shí)驗臺放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。

12、用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存備用�；厥�DNA時(shí)，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。

三、注意事項

1、測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液離心沉淀RNA，以400水重溶，測定OD260值，OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。

2、如果需要，可用oligo(dT)－纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無(wú)寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買(mǎi)試劑盒進(jìn)行mRNA的純化。

3、某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時(shí)），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進(jìn)行引物延伸反應時(shí)應會(huì )出問(wèn)題，反轉錄過(guò)程中法染的模板DNA片段可能會(huì )與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5'末端定位的錯誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。

a）步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動(dòng)微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個(gè)滅菌的微量離心管內。

b）用微量離心機于室溫以12,000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。

c）棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預冷的乙醇�；靹蛉芤�，在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12，000g離心10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。

d）棄上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。

回收RNA時(shí)，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。

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