厭氧菌的分離和培養

1.1 了解厭氧微生物的生長(cháng)特性

1.2 觀(guān)察厭氧微生物（雙歧桿菌）的形態(tài)特征

1.3 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養與計數技術(shù)

2 原理

目前培養厭氧微生物的簡(jiǎn)便而又有效的技術(shù)包括有：厭氧箱培養技術(shù)；厭氧罐培養技術(shù)；厭氧袋培養技術(shù)；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。這里介紹的是亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。

亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特（Hungate）于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術(shù)。以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趣完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。而且多年來(lái)的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專(zhuān)性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。

亨蓋特厭樣滾管培養技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養計數，還可以用于有害腐敗菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭狀芽孢桿菌）的分離與鑒定。

3 材料

3.1 樣品

雙歧酸奶（液體）、雙歧桿菌制劑（固體）。

3.2 培養基

改良MRS培養基，PTYG培養基。

3.3 儀器和器具

亨蓋特厭氧滾管裝置一套，厭氧管，厭氧瓶，滾管機，定量加樣器 

4 流程

銅柱除氧→預還原培養基→稀釋用液制備→稀釋樣品→滾管→培養→計數

5 方法

5.1銅柱系統除氧

銅柱是一個(gè)內部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來(lái)控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來(lái)的氣體如N₂、CO₂和H₂等通常都含有O₂，故當這些氣體通過(guò)溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏�。當向氧化狀的銅柱通入H₂時(shí)，H₂與CuO中的氧就結合形成H₂O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。

5.2 預還原培養基及稀釋液的制備

制作預還原培養基及稀釋液時(shí)，先將配制好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5-5ml，稀釋液裝9ml，并插入通N2氣的長(cháng)針頭以排除O₂。此時(shí)可以清楚地看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無(wú)色，說(shuō)明試管內已成為無(wú)氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。

5.3 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備

在無(wú)菌條件下準確稱(chēng)取1g固體或用無(wú)菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品，而后加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其震蕩均勻，制成10-1稀釋液。用無(wú)菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液至另一支裝有9ml生理鹽水的試管中，制成10-2稀釋液。按此操作方法依次進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7，制成不同濃度的樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管培養計數。

5.4厭氧滾管培養法

將盛有融化的無(wú)菌無(wú)氧瓊脂培養基試管放置于50℃左右的恒溫水浴中，用1ml無(wú)菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度的稀釋液各0.1ml于融化了的瓊脂培養基試管中，而后將其平放于盛有冰塊的盤(pán)中或特制的滾管機上迅速滾動(dòng)，這樣帶菌的融化培養基在試管內壁立即凝固成一薄層。每個(gè)稀釋度重復3次，而后置于37℃（酸奶樣品42℃）恒溫培養箱中培養。一般培養24—48小時(shí)后，即可在厭氧管的瓊脂層內或表面長(cháng)出肉眼可見(jiàn)的菌落。

5.5 雙歧桿菌活菌（分離）計數

選擇分散均勻，數量在幾十~幾百個(gè)菌落的厭氧試管進(jìn)行活菌計數，即可得出每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量。

5.6 計算

雙歧桿菌的活菌數量cfu/g(ml)樣品=0.1ml滾管計數的實(shí)際平均值×10×稀釋倍數

6 結果

6.1 觀(guān)察雙歧桿菌形態(tài)，描述其形態(tài)特征。
 

6.2 計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量，記錄結果。

7 思考

1 比較平板活菌計數和滾管活菌計數的異同？

2 實(shí)驗中通過(guò)哪些措施和方法保持細菌的厭氧狀態(tài)？

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