呼吸道合胞病毒空斑實(shí)驗方法匯總

方法一

1、以5×10e5/ml的密度接種Hep－2細胞到6孔板中，每孔加入3ml細胞懸液；

2、待細胞長(cháng)成單層后（不得超過(guò)48hr），移去營(yíng)養液，每孔加入400ul的PBS和100ul毒液（10倍系列稀釋?zhuān)��?/SPAN>

3、37℃，5％CO₂，吸附1-4h，每隔15－30分鐘應搖晃板子1次以令病毒分布均勻，病毒在4h時(shí)達到最高吸附度；

4、棄去吸附液，每孔添加覆蓋層3ml，少于3ml細胞不易存活。覆蓋層以含5％小牛血清的2×DMEM和0.6％的瓊脂糖按1：1比例混合而成，這樣小牛血清的終濃度為2.5％，瓊脂糖為0.3％。瓊脂糖必須高壓滅菌，用前以微波爐充分融解，并放置65℃水浴保溫待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去離子水融解即可，其中還可加入雙抗或二性霉素等，過(guò)濾除菌備用，用時(shí)37℃預熱。二者應充分混合且溫度不能過(guò)高（即無(wú)燙手感為止），否則會(huì )摧殘細胞；

5、37℃孵育6－7天，到時(shí)每孔添加約2ml的1％福爾馬林（以0.15M的NaCl配制），固定過(guò)夜使之充分滲透過(guò)覆蓋層。固定時(shí)間24h以上，無(wú)上限；

6、剔除覆蓋層，用自來(lái)水輕柔的沖洗平板邊緣殘留的瓊脂糖；

7、每孔添加2－3ml的0.05％中性紅。貯存液為10×的，可保存數月之久，工作液以去離子水稀釋即可；

8、室溫染色1h－1d，吸掉染液，輕柔地清洗并打開(kāi)蓋子令其干燥后即可保存數年之久；

9、空斑計算方法同其它方法。

參考文獻：Jennifer L.McKimm-Breschkin,A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaques without immunostaining,J.Viro Methd.120(2004):113-117

方法二

1、以5×10e5/ml密度接種Hela細胞于12孔板中，每孔1ml，使之24h內能長(cháng)成單層；

2、以2％DMEM（維持液）10倍系列稀釋好毒液；

3、吸去生長(cháng)液，PBS洗滌細胞1－2次，每孔加入維持液500ul；

4、每孔加入稀釋好的毒液50ul，充分混勻，每個(gè)稀釋度做2個(gè)復孔，37℃，5％CO2吸附2h，每隔5分鐘搖晃1次平板，以使之分布均勻；

5、微波爐充分融化無(wú)菌的3％瓊脂糖，65度水浴保溫備用，4％的2×DMEM預熱至37℃；取1個(gè)小培養瓶，分別加入等體積的瓊脂糖和DMEM，充分混合至溫度適合時(shí)每孔加入混合液1ml；

6、室溫或4℃放置板子致覆蓋層完全凝固，然后將之反扣過(guò)來(lái)，置37度培養4－5天，每天觀(guān)察細胞情況，注意保證培養箱內有保濕的蒸餾水，否則瓊脂糖易干裂；

7、取出板子，每孔加入100ul的MTT，37℃孵育4h，則可見(jiàn)清晰的空斑形成，活細胞染成藍色，選擇空斑不融合且分散單個(gè)的空斑計數計算pfu值即可。MTT即塞唑蘭，100mlDDW加入250mg配成0.25％濃度，-20℃凍存備用；

8、PFU計算方法同其它方法。

參考文獻：見(jiàn)重慶醫科大學(xué)兒童醫院免疫室廉國利博士論文《脫氧核酶在小鼠體內抗呼吸道合胞病毒的效應》。

方法三

1、試驗前一天用2×105HEP22細胞接種24孔板。37℃,5%CO2培育過(guò)夜。Hanks液沖洗細胞1～2次,用NaHCO3調Eagle MEM的pH值后稀釋RSV(10倍稀釋) ,然后加入24孔板中(設2個(gè)復孔),吸附1～2h,15～30min搖動(dòng)一次以保證蝕斑分布均勻；

2、以2倍的Eagle內加青鏈霉素、卡那霉素、碳酸氫鈉、瓊脂糖配成瓊脂覆蓋層；

3、倒出病毒液,加入瓊脂覆蓋層0.5ml ,冷凝后,倒置于34℃,5d后,用福爾馬林固定,0.15 %結晶紫染色,顯微鏡下數斑;

4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒樣品空斑形成單位,a指空斑均數,b指病毒稀釋度的倒數,v指病毒量）；

參考文獻：鄒毅，黃海鷺，徐軍，鐘南山.小鼠的原發(fā)性呼吸道合胞病毒感染.中華結核和呼吸雜志2001年8月第24卷第8期。

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