風(fēng)疹病毒分離標準程序

目的

根據中華人民共和國國家標準（GB17009-1997）“風(fēng)疹診斷標準及處理原則”，對風(fēng)疹病毒分離作必要的細化和補充，規范風(fēng)疹病毒分離方法。

適用范圍

本操作細則適用于從咽拭子、尿液標本中分離風(fēng)疹病毒。

操作細則

原理：病毒感染其敏感的靶細胞后，利用宿主細胞的細胞器、酶類(lèi)及其能量進(jìn)行病毒核酸復制，引起宿主細胞的形態(tài)學(xué)改變，出現細胞融合、壞死和脫落。

1、試劑來(lái)源

Vero/slam細胞由國家麻疹實(shí)驗室提供，使用代次不超過(guò)15代。

2、操作步驟

2.1維持液的配制     100ml
      DMEM                                         96mL
      7.5%碳酸氫鈉                              1mL
      胎牛血清                                      2mL
      青鏈霉素（10000U/mL)                  1mL

2.2細胞制備

在生物安全柜中將生長(cháng)良好的成片Vero/slam細胞瓶塞拔下，倒去培養液，加4mLEDTA胰酶混合消化液，蓋上瓶塞，當肉眼可見(jiàn)細胞層變成淡白色或顯微鏡下細胞開(kāi)始圓縮為度，拔去瓶塞，倒去消化液，加入10mL生長(cháng)液，用吸管沿瓶壁吹打，使細胞充分混勻。按所需細胞濃度加入營(yíng)養液分裝,10mL/瓶或5mL/瓶，放37℃孵箱內培養。傳代后2～3天，在顯微鏡下觀(guān)察單層細胞，以確保細胞生長(cháng)良好，備用。

2.3標本的處理

2.3.1咽拭子標本：低溫凍融三次，凍存于-70℃以下，備用。

2.3.2尿液標本：標本采集后24小時(shí)內送達試驗室，離心處理（4℃,2000rpm,20分鐘），棄上清，加入標本保存液1mL，低溫凍融三次，凍存于-70℃以下，備用。

2.4標本的接種

2.4.1將標本融化，無(wú)菌吸取0.2－0.5mL（根據細胞瓶大小決定）接種到生長(cháng)良好的單層vero/slam細胞瓶中，接種前倒去細胞培養液，使待檢樣品均勻地覆蓋在細胞上，置35℃孵箱內吸附1~2小時(shí)，吸附期間應輕輕搖動(dòng)2~3次，以避免細胞面干燥。另留1瓶細胞作為陰性對照。每一份標本接種1瓶細胞，并進(jìn)行正確標記（包括標本編號、接種日期、傳代數）。

2.4.2吸附完畢后，為防止標本對細胞產(chǎn)生毒性反應，棄去標本液，加入細胞維持液，每瓶5mL—10mL（大方瓶10mL/瓶，小方瓶5mL/瓶）。放35℃孵箱內培養。

2.5 結果觀(guān)察

2.5.1每天在顯微鏡下觀(guān)察方瓶中的細胞病變（CPE），并記錄融合性細胞的產(chǎn)生過(guò)程。如果培養基太酸（由橙色變?yōu)辄S色），需要更換細胞維持液。

2.5.2當出現典型的融合巨細胞病變+++時(shí)。將該瓶培養物凍存于-70℃冰箱，備作病毒鑒定之用。

2.5.3如經(jīng)7天培養未出現細胞病變，則再盲傳1代繼續觀(guān)察7天。由于風(fēng)疹病毒的細胞病變不明顯,連續傳代2次的分離物應進(jìn)行病毒鑒定后方可報告結果。

2.5.4細胞病變（CPE）的觀(guān)察記錄格式為：
      0～25%的細胞出現病變記錄為“+”；
      25%～50%的細胞出現病變記錄為“++”；
      50%～75%的細胞出現病變記錄為“+++”；
      75%～100%的細胞出現病變記錄為“++++”。

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