蘆薈多糖對鴨疫里默氏桿菌滅活菌苗免疫效果的影響

曹?chē)��?/SPAN>¹ 曾代勤¹ 劉俐君² 陳春林¹ 戴榮國¹

（1、重慶市畜牧科學(xué)研究院獸醫研究所 榮昌 402460 2、西南大學(xué)榮昌校區 ）

摘要：本試驗將蘆薈多糖作為免疫佐劑，制備蘆薈多糖里默氏桿菌滅活菌苗，接種3日齡雛鴨，首免后10天進(jìn)行二免，于首免后7d（以后間隔3d）采血分離血清，采用試管凝集反應監測其抗體升長(cháng)情況，并于首免后16d進(jìn)行攻毒試驗，比較蘆薈多糖佐劑菌苗與未加佐劑的甲醛滅活菌苗的免疫效果�？贵w檢測結果，蘆薈多糖能明顯促進(jìn)滅活菌苗特異性抗體的產(chǎn)生，尤其是高劑量（10mg/mL）蘆薈多糖組，產(chǎn)生抗體時(shí)間明顯早于低劑量（5mg/mL）組和未加蘆薈多糖組，而抗體滴度也明顯高于其它組；空白對照組血清中抗體滴度始終為零；甲醛滅活菌苗組具有一定免疫原性，但產(chǎn)生抗體的時(shí)間晚，滴度亦較低。攻毒試驗結果：高劑量蘆薈多糖組保護率為33.3％，而甲醛菌苗保護率僅11.1％，未注射疫苗組攻毒后全部死亡。試驗結果表明，蘆薈多糖佐劑滅活菌苗免疫效果明顯優(yōu)于未加蘆薈多糖的滅活菌苗，證明蘆薈多糖佐劑能夠增強滅活菌苗的免疫效果。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌   蘆薈多糖佐劑   滅活菌苗   免疫效果

鴨疫里默氏桿菌病又名鴨傳染性漿膜炎（Infectious  serositis  in duckling），該病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella  anatipestifer  RA）引起的嚴重危害雛鴨和幼鴨的一種傳染病。自1982年由郭玉璞^[1]首次報道本病以來(lái)，全國各省市自治區均相繼有報道。該病無(wú)明顯的季節性，一年四季均可發(fā)生，感染率可高達90%，死亡率1%～80%不等（高的可達90%以上）耐過(guò)鴨生長(cháng)不良，增重緩慢，失去飼養價(jià)值，而且該病在發(fā)病場(chǎng)能持續存在，引起不同批次的鴨感染發(fā)病，給養鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失^[2]。RA極易產(chǎn)生耐藥性，在臨床治療上已經(jīng)難以找到這種細菌敏感的藥物^[3]。由于該菌血清型多且交叉抗原存在較少，截止目前，抗菌藥物和自家菌苗成為治療和預防該病的有效措施^[4.5.6]。中藥作為免疫增強劑報道較多，但用作疫苗佐劑的報道較少，本試驗以中藥蘆薈提取多糖，作為疫苗佐劑添加于鴨疫里默氏桿菌甲醛滅活菌苗中，進(jìn)行免疫效果的對比試驗，獲得明顯的免疫增效作用，為尋求新的疫苗佐劑奠定了基礎，現將研究結果報道如下。

1.材料和方法

1.1實(shí)驗材料

鴨疫里氏桿菌菌株：標準Ⅰ型：由南京農業(yè)大學(xué)中國農業(yè)部動(dòng)物疫病重點(diǎn)診斷實(shí)驗室惠贈。野毒株分自重慶市九龍坡區白市驛某養鴨場(chǎng)。

蘆薈多糖：由重慶市畜牧科學(xué)研究院獸醫研究所動(dòng)物藥品研究中心從庫拉索蘆薈中提取，含多糖44％以上。

家兔與3日齡雛鴨：健康家兔與雛鴨，均購自榮昌縣水口寺農貿市場(chǎng)。

1.2主要試劑

營(yíng)養瓊脂培養基：（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司 批號：20041023）。兔血瓊脂培養基：營(yíng)養瓊脂培養基加5％兔血制成。麥康凱瓊脂培養基：（上海市醫學(xué)化驗所試劑廠(chǎng) 批號：930401）。革蘭氏染液、微量生化鑒定管、去離子水、生理鹽水均由重慶市畜牧科學(xué)研究院獸醫研究所自制。

1.3 主要儀器設備

生物攝影顯微鏡（BH-2.Olympus）、恒溫培養箱（PYX-YDH-50×6上海市躍進(jìn)醫療器械一廠(chǎng)）、4℃冰箱（華凌冰箱 BCO-188@HC 廣東廣州市）、-75℃超低溫冰箱（美國Revco ULT1386-3v）、超凈工作臺（蚌埠凈化設備廠(chǎng)）、高壓蒸汽滅菌器（上海佳勝實(shí)驗設備有限公司）、烘箱（CS101 3型。中華人民共和國重慶試驗設備廠(chǎng)）、離心機（TDL-5.上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）。各種相關(guān)試劑均均購自重慶市醫藥化學(xué)試劑公司。

1.4 細菌的分離鑒定

1.4.1 細菌的分離 

無(wú)菌取送檢病死雛鴨心血、肝及腦組織接種于鮮血瓊脂平板，于37℃恒溫箱培養24小時(shí)，挑取可疑菌落作初步形態(tài)學(xué)鑒定即染色鏡檢。

1.4.2 培養特性鑒定

 挑取鮮血平板經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的疑似病原菌分別接種于普通瓊脂培養基、改良瓊脂培養基、血清改良瓊脂培養基及鮮血瓊脂培養基和普通肉湯、改良肉湯、15%血清改良肉湯中，固體培養基置37℃恒溫培養箱靜置培養24～48小時(shí)，肉湯置振蕩培養箱培養24小時(shí)。觀(guān)察并記錄。

1.4.3 生化試驗

   挑取形態(tài)學(xué)和培養特性鑒定為疑似RA的鮮血平板菌落傳代接種于鮮血平板作純化增菌,取純化的菌落無(wú)菌接種于微量生化鑒定管,膠布封口,置37℃恒溫培養箱置培養過(guò)夜。同時(shí)，取純化的菌落接種于血清改良肉湯中置37℃振蕩培養箱培養，用于MR、VP及靛基質(zhì)試驗。

1.4.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗

選取4只10日齡健康雛鴨，將鮮血平板純化菌落洗下作為攻毒菌液，皮下注射0.5mL/只（含菌量1×10⁹cfu/mL），觀(guān)察并記錄結果。病死鴨剖解，無(wú)菌取心血劃線(xiàn)于鮮血平板培養基培養，觀(guān)察有否細菌生長(cháng)及菌落形態(tài)特征。

1.5 兩種滅活菌苗的制備

1.5.1 增菌與滅活   取鑒定并純化的RA接種于鮮血平板進(jìn)行大規模增菌培養，滅菌生理鹽水洗滌。按0.5：100體積比加入甲醛溶液置37℃過(guò)夜滅活(每隔4～6小時(shí)振搖一次)。取少量滅活菌液以麥氏比濁法測定細菌濃度后備用。

1.5.2 疫苗的制備   用滅菌生理鹽水將菌液稀釋成終濃度為200億/mL。按比例加入蘆薈多糖佐劑，制成含蘆薈多糖（以多糖計）5mg/mL、10mg/mL的兩種佐劑菌苗，振搖15min后備用。

1.5.3 兩種滅活苗無(wú)菌及安全性檢驗   取已經(jīng)制備好的甲醛滅活菌苗及蘆薈多糖佐劑滅活菌苗各1mL，均勻涂布于鮮血平板，37℃恒溫培養箱靜置過(guò)夜，觀(guān)察有否細菌生長(cháng)。取18只非免疫10日齡雛鴨，分成兩組，分別進(jìn)行安全性測定。每組接種3個(gè)免疫劑量梯度，即0.5mL/只、1mL/只、2mLl/只，每個(gè)梯度接種3只鴨，觀(guān)察10 d。

1.6 兩種滅活菌苗免疫效果對比試驗

1.6.1免疫接種程序與劑量   按表1進(jìn)行免疫接種。

表1 兩種菌苗免疫接種程序及劑量

Table 1 the inoculation formality and dosage of the two kinds of bacteria vaccines

備注：1、含蘆薈多糖5mg/mL；2、含蘆薈多糖10mg/mL；3、二免在第一次免疫后的第10天進(jìn)行。

1.6.2 待檢血清的采取與制備

    免疫后第7d，從每組10只鴨中隨機選取5只，用一次性注射器按1mL/次采集頸靜脈血液。以后每隔3d采血一次直至1個(gè)月。采集鮮血轉入滅菌5mL離心管（有蓋），37℃溫箱作用30min，后轉入4℃冰箱沉析，取上清液即為待檢血清，4℃冰箱保存備用。

1.6.3 抗體的檢測   采用試管凝集反應^[6]檢測兩種滅活菌苗免疫后的抗體升長(cháng)情況，比較其兩種菌苗的免疫效果。

1.6.4攻毒試驗  首免后第16d，選擇空白對照組、無(wú)佐劑菌苗組和高含量蘆薈多糖菌苗組試驗鴨，以野毒菌株培養物（約6×10⁹CFU/ml）進(jìn)行攻毒試驗，觀(guān)察其發(fā)病與死亡情況。

2.結果與分析

2.1鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定：通過(guò)對疑似病原菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察，該菌呈細小短桿菌，革蘭氏陰性，兩極略濃染，散在或成群分布；菌落呈邊緣整齊的圓形，中央隆突，乳白色或奶油色，鮮血平板菌落呈露滴狀，有熒光反應。該菌不在普通瓊脂培養基、普通肉湯、改良肉湯、改良瓊脂平板生長(cháng)，能在血清肉湯培養基和血清瓊脂培養基及鮮血平板生長(cháng)，要求營(yíng)養條件較高。生化特性鑒別試驗結果，除蔗糖陽(yáng)性外，半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、H₂S、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素及MR試驗、VP試驗、靛基質(zhì)試驗均為陰性，與標準菌株一致。動(dòng)物回歸試驗，被接種疑似鴨疫里默氏桿菌病原菌的試驗鴨表現出較典型的鴨傳染性漿膜炎癥狀，尤其剖檢時(shí)肝與心包膜纖維素沉積最為顯著(zhù)。綜上表明，該送檢病鴨是由鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎。

2.2 通過(guò)無(wú)菌檢驗和安全性檢驗表明，鴨疫里默氏桿菌蘆薈多糖佐劑滅活苗與甲醛滅活苗均未受細菌污染；注射2mL/只雛鴨不表現毒副反應，表明安全性較好。

2.3 兩種鴨疫里默氏桿菌滅活菌苗免疫后抗體效價(jià)的測定：結果見(jiàn)表2。

表2  兩種滅活菌苗免疫后抗體測定結果

Table 2 the specific antibody response to AR in ducks immunized with the two kinds killed bacteria

備注:1.樣本數是指隨機采取血清樣品的每組試驗鴨數目；2.抗體滴度是以所測5個(gè)樣本的平均數；3、采血時(shí)間。

盧新華1993^[7]報道，美國1992年將從蘆薈中提取的“甘露聚糖”作為免疫增強劑應用于馬立克疫苗，可增強肉雞的免疫應答。國內陸鋼等（1995）^【8】研究了蘆薈對雛雞IBD攻毒前后免疫器官的影響，證實(shí)蘆薈有促進(jìn)雛雞免疫器官發(fā)育和增重的作用，但將其作為滅活菌苗佐劑在國內尚未見(jiàn)報道。本研究以蘆薈多糖作為鴨疫里默氏桿菌滅活菌苗佐劑，探討蘆薈多糖作為佐劑的免疫原性和增效作用。結果表明，蘆薈多糖能明顯增強疫苗的免疫效果，尤其當蘆薈多糖為10mg/mL時(shí)，RA滅活菌苗產(chǎn)生抗體的時(shí)間明顯早于5mg/mL劑量滅活菌苗組和未加佐劑菌苗組，且抗體滴度高，維持高滴度的時(shí)間較長(cháng)。未加佐劑的甲醛滅活菌苗具有一定的免疫原性，但產(chǎn)生抗體的時(shí)間較晚，滴度較低。

2.4兩種鴨疫里默氏桿菌滅活菌苗免疫組攻毒試驗結果：首免后第16d，選擇空白對照組、甲醛菌苗組和高含量蘆薈多糖菌苗組試驗鴨，進(jìn)行攻毒試驗，結果見(jiàn)表3。

表3 兩種菌苗免疫16d后攻毒試驗結果

Table 3 the results of virus attacking test at day 16 post primary immunization of the two bacteria vaccines

表3結果證實(shí)，未接種疫苗組鴨全部發(fā)病死亡，甲醛菌苗組保護率僅11.1％，而蘆薈多糖菌苗組保護率遠高于甲醛菌苗組，達到33.3％。攻毒試驗保護率不高，原因可能有二：一是攻毒時(shí)間可能不合適，由于滅活菌苗產(chǎn)生特異性保護抗體較慢，攻毒時(shí)的抗體滴度較低，還不能產(chǎn)生很好的保護作用；二是攻毒用菌量可能過(guò)大，加之本菌是新分離的野毒株，致病力較強，用前未做適宜用量的篩選。但從本試驗結果仍可以看出，蘆薈多糖確有增強疫苗免疫效力的作用。

3.結論

本試驗將蘆薈多糖作為免疫佐劑，制備蘆薈多糖鴨疫里默氏桿菌滅活菌苗，接種3日齡雛鴨（每只0.5mL）。首免后10天進(jìn)行二免，于首免后7d（以后間隔3d）采血分離血清，采用試管凝集反應監測其抗體升長(cháng)情況，并于首免后16d進(jìn)行攻毒試驗，比較蘆薈多糖佐劑菌苗與未加佐劑的甲醛滅活菌苗的免疫效果�？贵w檢測結果，蘆薈多糖能明顯促進(jìn)滅活菌苗特異性抗體的產(chǎn)生，尤其是高含量（10mg/mL）蘆薈多糖組，產(chǎn)生抗體時(shí)間明顯早于低含量（5mg/mL）組和未加蘆薈多糖組，而抗體滴度也明顯高于其它組；甲醛滅活菌苗組具有一定免疫原性，但產(chǎn)生抗體的時(shí)間晚，滴度亦較低。攻毒試驗結果：高含量蘆薈多糖組保護率為33.3％，而甲醛菌苗保護率僅11.1％，未注射疫苗組攻毒后全部死亡。試驗結果表明，蘆薈多糖佐劑滅活菌苗免疫效果明顯優(yōu)于未加蘆薈多糖的滅活菌苗，證明蘆薈多糖佐劑能夠增強滅活菌苗的免疫效果。

4.參考文獻：

[1] 郭玉璞，陳德威，范國雄等.畜牧獸醫學(xué)報[J].1982，13（2）：7-13

[2] 鄭騰，李昂，陳枝華.鴨傳染性漿膜炎的診斷和防治現狀及進(jìn)展.中國家禽[J]，2002，21：40～42

[3] 程安春，汪銘書(shū).最新鴨病診斷與防治[M].成都：四川大學(xué)出版社，1995.8.

[4]  Pathanasophon P..New serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thai land[J].Avian Pathol,1995,24:：195～199.

[5] 程安春，汪銘書(shū)，陳孝躍等.我國鴨疫里默氏桿菌血清型的調查及新血清型的發(fā)現和病原特性.中國獸醫學(xué)報[J]，2003，23（4）：320-323

[6] 張大丙，郭玉璞.我國鴨疫里氏桿菌血清型的鑒定.畜牧獸醫學(xué)報[J]，1999，30(6)：536-542

[7] 盧新華，用蘆薈提取物“甘露聚糖”增強肉雞的免疫應答.國外畜牧學(xué)－豬與禽[J]. 1993.（3）：53～54

[8]  陸鋼，邊慶華，劉瑞萍. 蘆薈蜂膠花粉對雛雞IBD攻毒前后免疫器官的影響. 中國獸醫雜[J].1995（21）9：37～40

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