青霉遺傳轉化系統的研究進(jìn)展

  青霉遺傳轉化系統的研究進(jìn)展

邢 偉（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716）

【摘　要】　青霉在自然界中是普遍存在的,在工業(yè)、農業(yè)和醫藥領(lǐng)域有著(zhù)重要的應用和研究?jì)r(jià)值。有關(guān)青霉的遺傳轉化體系已經(jīng)建立。本文就青霉的轉化方法、轉化載體啟動(dòng)子的選擇、選擇性標記，及其在青霉研究中的應用進(jìn)行了綜述。

　　【關(guān)鍵詞】　青霉，遺傳轉化，載體 

　　青霉是真菌中的一大類(lèi)群,包括一些重要的工業(yè)生產(chǎn)微生物，能夠產(chǎn)生許多有生物活性的小分子次級代謝產(chǎn)物，如青霉素。但是，這些活性物質(zhì)是微生物發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量往往較低，因此需要通過(guò)改良菌種等策略來(lái)提高其產(chǎn)量。分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，為構建基因工程菌株提供了可能，給菌種改良工作帶來(lái)了更加直接的有效的方法。

　　遺傳轉化是人們進(jìn)行菌種改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途徑。自1973年Mishra 和Tatum首次報道粗糙脈孢菌轉化以來(lái)^[1]，絲狀真菌遺傳轉化系統研究發(fā)展非常迅速，絲狀真菌的遺傳轉化系統已基本建立。關(guān)于青霉屬真菌的遺傳轉化也有報道。本文著(zhù)重在青霉屬絲狀遺傳轉化系統的最新進(jìn)展方面作一介紹。

1　轉化方法

1.1  原生質(zhì)體轉化方法

　　采用酶法消化細胞壁制備原生質(zhì)體，利用原生質(zhì)體作為外源基因的受體細胞，是克服細胞壁障礙的有效方法之一。目前常用的細胞壁裂解酶為 Novozyme 234、纖維素酶和蝸牛酶等。Nara等人^[2]已經(jīng)建立了美伐他汀產(chǎn)生菌桔青霉的原生質(zhì)體轉化系統。而且，他們發(fā)現原生質(zhì)體轉化效率受到包括PEG、二甲基亞砜(DMSO)和肝素等多種因素的影響。PEG的濃度對于轉化效率有顯著(zhù)的影響，而且是非線(xiàn)性關(guān)系。與PEG4000相比，PEG8000更有利于轉化效率的提高。DMSO對轉化具有抑制作用，肝素則能顯著(zhù)促進(jìn)轉化。另外，在其他青霉種屬中，相應的原生質(zhì)體轉化體系也已建立。如產(chǎn)黃青霉^[3]、草酸青霉P8^[4]、微紫青霉菌^[5]。

1.2  農桿菌介導的青霉遺傳轉化方法

　　農桿菌介導轉化方法ATMT 最初多用于植物遺傳工程。近來(lái)ATMT轉化技術(shù)已擴展到絲狀真菌，Groot等[6]利用ATMT成功轉化了多種絲狀真菌。

　　在青霉中，孫傳寶等人[7]利用ATMT方法，通過(guò)根瘤農桿菌LBA4404 Ti質(zhì)粒介導建立一個(gè)高效的產(chǎn)黃青霉遺傳轉化體系。利用根瘤農桿菌介導轉化產(chǎn)黃青霉孢子時(shí)需要有乙酰丁香酮誘導，但轉化菌絲體時(shí)乙酰丁香酮不是必要的, 但一定濃度的乙酰丁香酮可提高轉化率。與原生質(zhì)體轉化法相比可提高轉化率10倍左右。ATMT轉化法獲得的轉化子在生理特性上原始菌株表型相同。

　　根癌農桿菌介導的絲狀真菌遺傳轉化是近年建立起來(lái)的一種新方法,克服了原生質(zhì)體轉化的缺點(diǎn)，農桿菌介導轉化法具有四個(gè)特點(diǎn):一是受體來(lái)源廣泛，原生質(zhì)體、孢子、菌絲和子實(shí)體都可以直接用于轉化；二是轉化穩定；三是轉化效率高；四是單拷貝插入。隨著(zhù)ATMT轉化絲狀真菌種類(lèi)逐漸增多，ATMT已經(jīng)成為絲狀真菌遺傳轉化的重要手段

2　青霉轉化載體的選擇標記基因

2.1  營(yíng)養缺陷型互補基因

　　營(yíng)養缺陷型互補基因是通過(guò)轉入的標記基因與受體細胞缺陷基因互補,使受體細胞表現野生型生長(cháng)而作為選擇標記的。目前,常用于青霉轉化的營(yíng)養缺陷型互補基因有產(chǎn)黃青霉的trpC基因（編碼色氨酸合成酶）和pyrG 基因（編碼尿嘧啶營(yíng)養缺陷型互補基因）等^[8]。由于使用營(yíng)養缺陷型標記要求有特定營(yíng)養缺陷型受體菌, 因而限制了這一選擇性標記的使用。

2.2  抗生素抗性基因

　　抗性基因的轉入可以使受體細胞在一定的藥物濃度下生長(cháng)，表現出藥物抗性,不要求受體菌具有營(yíng)養缺陷型,使用起來(lái)較為方便,促進(jìn)了藥物抗性標記在青霉等絲狀真菌轉化中的應用。常用抗性標記有：潮霉素抗性基因，腐草霉素（phleomycin）抗性基因，苯菌靈抗性基因(Benr)，博來(lái)霉素(bleomycin) 抗性基因。HygB已用于篩選桔青霉和草酸青霉菌P8轉化子[2,4],得到了抗藥性穩定的轉化子。Benr用于微紫青霉菌菌株GXCR的遺傳轉化[5]。博萊霉素和腐草霉素抗性基因在產(chǎn)黃青霉中得到應用[3,7]。

2.3  綠色熒光蛋白

　　綠色熒光蛋白GFP是從水母體內發(fā)現的一種發(fā)光蛋白綠光，這種發(fā)光的標簽已廣泛應用于遺傳學(xué)，生化學(xué)和分子生物學(xué)。張磊等人[4]構建了綠色熒光蛋白和潮霉素抗性雙標記載體轉化草酸青霉菌P8，篩選出穩定、高效表達GFP并對潮霉素產(chǎn)生抗性的轉化菌株。

3　青霉轉化載體啟動(dòng)子的選擇

　　由于啟動(dòng)子在不同生物間的種屬差異，載體中的真核啟動(dòng)子必須是來(lái)源于受體菌自身或相近種屬。

　　目前，用于青霉轉化的真核啟動(dòng)子主要有：來(lái)源于構巢曲霉的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動(dòng)子PgpdA、色氨酸合成基因trpC的啟動(dòng)子PtrpC[9]和磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子Ppgk[2],來(lái)源于泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶啟動(dòng)子Pgdh[8]，粗糙脈胞霉氨基酸合成交叉途徑控制基因cpc的啟動(dòng)子Pcpc[9]，產(chǎn)黃青霉異青霉素N合成酶（IPNS）基因pcbC的啟動(dòng)子Pipns[9]。這些啟動(dòng)子在青霉中均有活性，但是它們啟動(dòng)基因表達的能力有較大差異。任志紅[9]等對幾種啟動(dòng)子在產(chǎn)黃青霉中效率評價(jià),結果發(fā)現四種啟動(dòng)子的強弱的順序為PgpdA>Pcpc>Pipns>PtrpC,研究結果也表明選擇性標記基因受強啟動(dòng)子驅動(dòng)可以提高產(chǎn)黃青霉工業(yè)生產(chǎn)菌種的轉基因效率。

4　青霉遺傳轉化系統的應用與展望

　　青霉遺傳轉化系統的建立為人們從基因水平研究絲狀真菌的基因功能和菌株改造提供了條件,通過(guò)轉化把外源基因導入絲狀真菌細胞,構建基因缺失突變體或高表達菌株，來(lái)分析基因的功能及其表達調控機理，以及改良工業(yè)業(yè)生產(chǎn)菌株。例如，在桔青霉中[10-11]，通過(guò)遺傳操作，對美伐他汀生物合成基因簇中的各個(gè)催化步驟相關(guān)酶基因功能研究及其途徑特異性調控因子MlcR的功能研究，及高產(chǎn)基因工程菌的培育。通過(guò)構建laeA基因沉默或高表達菌株，研究表明全局性調控因子laeA對產(chǎn)黃青霉中青霉素的生物合成有正調控作用[8]。

參考文獻

[1]Mishra N C and Tatum E L.Non-Mendelian inheritance of DNA-induced inositol independence in Neurospora.Tech Tips Online,1973,70:3875-3879.

[2]Nara.F,Watanabe.I,Serizawa.N.Development of a transformation system for the filamentous,ML-236B(Compactin) producing fungus Penicillium citrinum.Current Genetics,1993,23(1):28-32.

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[4]張磊，范丙全,黃為一.綠色熒光蛋白和潮霉素抗性雙標記載體轉化草酸青霉菌P8的研究[J].微生物學(xué)報,2005,45(6):842-845.

[5]玉榮,賴(lài)洪敏,劉楊等.高抗重金屬鹽的微紫青霉菌( Penicillium janthinellum)菌株GXCR的遺傳轉化[J].廣西農業(yè)生物科學(xué),2008,27(1):31-36.

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[8]Katarina Kosalkova´,Carlos Garcı´a-Estrada, Ricardo V.Ulla´n,et al.The global regulator LaeA controls penicillin biosynthesis,pigmentation and sporulation,but not roquefortine C synthesis in Penicillium chrysogenum.Biochimie,2009,91(2):214-225.

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