紅曲米中七株紅曲霉純培養的分離鑒定

關(guān)鍵詞：紅曲米；紅曲霉；分純；鑒定 

中圖分類(lèi)號：TS201.3                        文獻標識碼：A

自1884 年Van Tieghen 首次分離出紅曲霉，至今已有百年的歷史。近幾年紅曲霉的許多功效相繼被證實(shí)后，紅曲菌的相關(guān)專(zhuān)利陸續出現。自1975年至1997年為止各國關(guān)于紅曲霉的專(zhuān)利將近200 篇^[1]。目前紅曲色素應用是紅曲研究的主要方向，近20年有近40%的專(zhuān)利都在此領(lǐng)域。1979 年紅曲霉被發(fā)現可產(chǎn)生膽固醇合成抑制劑，紅曲霉降血糖、血壓及膽固醇功效即成為眾人關(guān)注的焦點(diǎn) ^[2]。

另外作為食品添加劑也是紅曲應用的主要方向，有關(guān)添加紅曲成為功能性食品的專(zhuān)利有31篇，且多在日本申請。還有用于生產(chǎn)各種酶的專(zhuān)利15篇，以及在化妝品、處理廢水、飼料上的應用^[3]。對紅曲霉的研究已從紅曲色素擴展到有關(guān)降血壓、血糖及膽固醇，紅曲霉抗菌作用等多個(gè)方面。

本論文報道了對廣西所產(chǎn)紅曲米中紅曲霉的分離純化工作。對廣西武宣一帶的紅曲米中的紅曲霉進(jìn)行分純，得到了7個(gè)純培養，進(jìn)行了屬的鑒定。發(fā)現其中一株有較為突出的抗菌能力（另文發(fā)表）；還有一株有較為突出的產(chǎn)紅曲色素能力。研究成果擴大了紅曲霉的菌種庫，為發(fā)掘紅曲霉生物資源做了有益工作。

1  實(shí)驗材料

1.1  紅曲米：取自廣西武宣地區，是居民制作紅糟酸所用的發(fā)酵劑。

1.2  培養基：富集活化液：12⁰Bx米曲汁900mL，乳酸7mL，無(wú)水乙醇100mL，于121℃滅菌20min，使用時(shí)以無(wú)菌操作加入30ppm鏈霉素。分純培養基: 12⁰Bx米曲汁900mL，6％NaCl，2％瓊脂，121℃滅菌30min。

2  研究方法

2.1  紅曲霉的分純與鑒定：取紅曲米25粒放入100mL富集活化液中，30℃培養５天。采用

米曲瓊脂汁培養基，對數稀釋傾注法分純。以無(wú)菌操作將生長(cháng)迅速、健壯的菌落，挑取放到

富集活化液中繼續富集活化，待培養5天后重復上述分純操作，經(jīng)過(guò)多次操作就可以分離得

到紅曲霉純培養。

    通過(guò)菌落形態(tài)、菌絲體形態(tài)觀(guān)察，耐酒精、耐NaCl實(shí)驗，進(jìn)行紅曲霉純培養的鑒定。

2.2  紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究：用米曲汁培養基，遮光，32℃，160r/min 培養六天。用分光光度法測定總色價(jià)。

3  實(shí)驗結果

3.1  紅曲霉的富集活化

活化培養的第二天，紅曲米開(kāi)始有附著(zhù)的白色菌絲；第三天紅曲米上浮，米身附著(zhù)大量菌絲；第四天紅曲米全部上浮，菌絲開(kāi)始粘連；五天以后出現白色菌膜；七八天后白色菌膜轉變?yōu)榧t色。根據菌體質(zhì)量測定，紅曲霉生長(cháng)對數期大約處于第五、第六天，最適合用作接種材料。

3.2  紅曲霉的分離鑒定：

3.2.1  菌落形態(tài)特征。紅曲霉培養初期都為白色小菌落，經(jīng)過(guò)培養后，菌落開(kāi)始老熟，表面的顏色變化比較豐富，有的菌落顏色開(kāi)始改變，逐漸變成橙色、淺藍色、灰色、鉛灰色和灰白色等；菌落的主要形狀為皮膜狀和絨毯狀，大多菌落有放射狀的溝紋，邊沿一般比較整齊。得到7個(gè)純培養，菌落特征見(jiàn)表1。

表1　 7株紅曲霉純培養的菌落形態(tài)

菌株   菌落大小   正面形態(tài)      皺折      顏色    側面觀(guān)     背面顏色     

編號    (mm)                                  

M-1     38       圓形絨墊狀    輻射狀     紅色      凸起      深紅色

M-2     20       圓形皮膜狀    有皺折     白色     不凸起      紅色      

M-3     38       圓形絨墊狀    輻射狀     橙色      凸起       橙色

M-4     40       圓形皮膜狀    輻射狀     白綠灰^①不明顯      橙色

M-5     29       圓形皮膜狀    不明顯     白鉛綠^②  不凸起      橙色

M-6     20       圓形皮膜狀    不明顯     白綠^③    不凸起      橙色

M-7     42       圓形絨墊狀    不明顯     白色     不凸起      橙色

注:①菌落從里至外為三個(gè)色環(huán)，顏色依次為灰色、綠色和白色；②菌落從里至外為兩個(gè)色環(huán)，顏色依次為灰色和白色；③菌落從里至外為兩個(gè)色環(huán)，顏色依次為綠色和白色。

3.2.2  個(gè)體形態(tài)特征。30℃培養3天的紅曲霉純培養，用手術(shù)刀切取大小約1×1ｍｍ的菌苔，制成水浸片，鏡檢觀(guān)察個(gè)體形態(tài)，7個(gè)菌株均觀(guān)察到細胞橫隔，有足細胞，梨形的分生孢子，有的還觀(guān)察到閉囊殼結構．

3.2.3  曲霉純培養的分類(lèi)

根據以上形態(tài)觀(guān)察結果，將７株純培養鑒定為紅曲霉屬^[4]。

根據1992年ATCC真菌目錄，紅曲霉菌主要可分為三大類(lèi)。按照文獻的檢索方法對所得的7個(gè)菌株進(jìn)行測定后，分類(lèi)結果見(jiàn)表2。

表2  ７株紅曲霉純培養的分類(lèi)結果

類(lèi)別          MEA上菌落直徑（mm）       色素顆粒        菌株編號

 M.purpureur         < 28mm                 有             M-2 M-6 M-1

M.pilosus           > 28mm                 有             M-3 M-7

M.ruber             > 28mm                 無(wú)             M-5 M-4

M-1、M-2、M-6屬于紫色紅曲霉類(lèi)(M.purpureus)，M-4、M-5屬于紅色紅曲霉類(lèi)(M.ruber)，M-3、M-7屬于叢毛狀紅曲霉類(lèi)(M.pilosus)。 

3.3  M-1的紅曲色素產(chǎn)生能力

分純過(guò)程中發(fā)現M-1菌株的菌落及其培養液顯示出突出的紅色。我們對其進(jìn)行了種的鑒定和紅曲色素產(chǎn)生能力的測定。

          3.3.1  根據PDA平板上30℃培養7天的結果和耐乙醇、NaCl特征可以對M-1菌株進(jìn)一步分類(lèi)，結果如表3所示。

表3  M-1菌株的分類(lèi)特征

菌株      形成      菌落      分生孢子     產(chǎn)色素     耐30％     耐6％

代號     閉囊殼     形狀       鏈形狀                  乙醇       NaCl

M-1       否       溶巖狀      螺旋        產(chǎn)生      不耐        不耐

根據檢索表^[5]，將M-1菌株鑒定為M.purpureus Wen紫色紅曲菌。

3.2.2  M-1、M-2、M-3、M-4產(chǎn)紅曲色素的能力

米曲汁培養基，32℃，160r/min遮光培養六天。用分光光度法測定總色價(jià)。結果見(jiàn)表4。

表4  M-1，M-2 ，M-3， M-4菌株產(chǎn)色素能力對比

菌株        Ｍ－１          Ｍ－２           Ｍ－３         Ｍ－４

第一次      146.6           89.8             62.1            62.5

第二次      143.3           83.8             57.3            59.2

第三次      142.6           81.3             60.8            57.1

平均       144.2           85.0             60.1            59.6

可見(jiàn)M-１菌株產(chǎn)紅曲色素能力十分突出，發(fā)酵液總色價(jià)為144.2μ/mL。

4  結論

4.1  從廣西武宣紅曲米中獲得了7 個(gè)紅曲霉純培養。M-2、M-6、M-1屬于紫色紅曲霉類(lèi)(M.purpureus)，M-5、M-4屬于紅色紅曲霉類(lèi)(M.ruber)，M-3、M-7屬于叢毛狀紅曲霉類(lèi)(M.pilosus)。

4.2  成功篩選到一株發(fā)酵液總色價(jià)為144.2μ/ml的紅曲霉菌株M-1。經(jīng)形態(tài)觀(guān)察和耐酒精、耐NaCl能力實(shí)驗鑒定為紫色紅曲霉（M.purpureus Wen）。說(shuō)明廣西武宣地區的紅曲米中的紅曲霉在產(chǎn)生紅曲色素方面具有較高的研究潛力。

4.3  關(guān)于M-1號菌株所產(chǎn)色素的成分、性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究和探討。以M-1作為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變育種和基因工程，開(kāi)發(fā)紅曲色素生產(chǎn)菌株具有研究?jì)r(jià)值。

參考文獻

[1] 陳彥霖,李昭蓉,陳建州等.紅曲菌種的研究開(kāi)發(fā)與應用[J].食品工業(yè)月刊(臺),1998,30.

[2] 路秀玲,趙樹(shù)欣,宮慧梅.紅曲霉的應用研究現狀與展望[J].食品科技,2001,(1):43-46.

[3] 賈波,周立平.紅曲霉研究之現狀及發(fā)展前景[J].中國食品添加劑,2002, (6):32-35.   

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上�？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979:129-136.

[5] 戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類(lèi)[M].北京:科學(xué)出版社,1987.3.

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