細菌纖維素酶研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞：細菌；纖維素酶；基因克��；結構與功能

1  引言

目前，纖維素是最豐富的可再生有機資源，其生物降解主要由微生物——細菌和真菌完成。細菌主要產(chǎn)中性纖維素酶和堿性纖維素酶，這類(lèi)酶制劑對天然纖維素的水解作用較弱，長(cháng)期以來(lái)沒(méi)有得到足夠的重視。但原核生物的基因一般不含內含子，可直接從基因組DNA中克隆到目的基因用于工程菌的構建。因此細菌纖維素酶基因的克隆，既利于研究纖維素酶基因的多樣性，也利于高效纖維素酶基因工程菌的構建。隨著(zhù)中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應用，以及耐熱性纖維素酶在燃料酒精生產(chǎn)中應用，細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應用性能和巨大的經(jīng)濟價(jià)值。

2  纖維素分解性細菌的類(lèi)群

纖維素分解性細菌是指能分解纖維素的細菌，分三大類(lèi)群：（1）厭氧發(fā)酵型：芽孢梭菌屬（Clostridium）、牛黃瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcusalbus）、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌（Bacteroides succinogenes）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobactersuccinogenes）、溶纖維菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）、解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）；（2）好氧型：糞堿纖維單胞菌（Cellulomonasfimi）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、發(fā)酵單胞菌（Zymomonas）、混合纖維弧菌（Cellvibrimixtus）；（3）好氧滑動(dòng)菌，如噬胞菌屬（Cytophaga）。

3  細菌纖維素酶基因的克隆與表達

細菌中編碼纖維素酶的基因在基因組的分布為隨機的或形成基因簇。在基因簇中，有轉錄終止子，沒(méi)發(fā)現有啟動(dòng)子。人們已從40多種細菌中克隆到了纖維素酶基因，其中一些酶基因已經(jīng)在大腸桿菌和酵母中得到表達。如從Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaer obacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter 和 Bacillus 中成功分離出葡聚糖基因，并先后克隆了瘤胃的Bacteroides、succi  nogenes 、Butyrivibrio sp Ruminococcus albus等細菌的纖維素酶基因，同時(shí)熱梭菌中的11種內切纖維素酶（CelA、CelB、CelD、CelE、CelF、CelG、CelH、CelI、CelJ、CelK、CelS）的基因已經(jīng)被克隆，嗜纖維梭菌的5種內切纖維素酶（EngA、EngB、EngC、EngD、EngE）已經(jīng)測序并在大腸桿菌中得到表達。楊智源、劉永生、游銀偉等從不同的細菌中克隆了內切葡聚糖酶基因^[1-3]。Kim等克隆了Aquifex aeolicus VF5編碼EG的 ce18Y基因，在E.coli XL1 -Blue中成功表達，Hakamada等運用盒式連接介導PCR 和反向PCR 克隆到了基因egl-257。人們將纖維素酶、纖維二糖等外源基因轉入運動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）中并得到不同程度的表達，有望將它改造為能將纖維素轉化為乙醇的重組菌株并在工業(yè)中廣泛應用。細菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的啟動(dòng)子和信號肽的控制下構建在同一質(zhì)粒載體上，然后轉入S.cerevisiae， 重組菌可向培養基分泌保留70%活性的葡聚糖內切酶和外切酶，這種酶能夠分解濾紙和木漿中的纖維素。

4  細菌纖維素酶分類(lèi)

細菌纖維素酶是多酶復合體系，根據各酶的功能可分為三大類(lèi)：（1）內切葡聚糖酶（1,4-D-glueanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4），簡(jiǎn)稱(chēng)Cen。作用于纖維素內部的非結晶區，隨機水解β-1,4-糖苷鍵，將長(cháng)鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大小約為23-146KD。（2）外切葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-β-D-glucan cellobio-hydrolase或exo-1,4-β-D- glucanase,EC3. 2.1.91)，簡(jiǎn)稱(chēng)Cex。作用于纖維素線(xiàn)狀分子末端，水解β-1，4-D-14糖苷鍵，依次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱(chēng)為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)，分子量約38-118 KD。（3）β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase, EC3.2.1.21）簡(jiǎn)稱(chēng)BG或稱(chēng)纖維二糖酶。這類(lèi)酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD。

5  細菌纖維素酶水解機制

好氧細菌的三種纖維素酶是以各自獨立的形式分泌到細胞外水解纖維素的；厭氧細菌的三種纖維素酶以多酶復合體形式結合在細胞壁上對纖維素進(jìn)行水解。細菌纖維素酶通過(guò)多酶復合體系各組分協(xié)同作用徹底有效降解天然纖維素。Cen負責進(jìn)攻纖維素的非結晶區，隨機水解β- 1，4 - 糖苷鍵，將長(cháng)鍵纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素，Cex負責從纖維素線(xiàn)狀分子的非還原性末端水解切下纖維二糖單位，BG則將纖維二糖水解成葡萄糖，但對于Cen和Cex 的作用順序尚未定論。 

在已知結構的細菌纖維素酶分子中，通過(guò)在異頭碳原子位通過(guò)構型的保留或構型的轉化完成催化反應，其中兩個(gè)保守的羧基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑，如C . thernmocellum的內切酶CelC催化域中Glu-280和Glu-140分別作親核試劑和質(zhì)子供體, C .fimi的外切酶Cex的Glu-574和Glu-645分別作親核試劑和質(zhì)子供體，證明了細菌纖維素酶降解纖維素的水解雙置換機制。由于纖維素底物的高度復雜性以及底物的多樣性，纖維素水解過(guò)程的并沒(méi)有完全清楚。因此，纖維素酶系的降解機理還有待進(jìn)一步研究和探討。

6  細菌纖維素酶的結構和功能

通過(guò)對糞堿纖維單胞菌（Cellulomonas fimi）的一個(gè)外切酶Cex和一個(gè)內切酶CenA的研究表明，細菌纖維素酶的纖維素結合結構域（CBD）位于氨基端或羧基端，它借助連接橋（Linker）與催化結構域（CD）連接。在多種細菌的纖維素酶中發(fā)現有相似的結構^[8]。

6.1  催化結構域（CD）

纖維素酶分子的催化結構域主要體現酶的催化活性及對特定水溶性底物的特異性。不同來(lái)源纖維素酶分子量差別很大，但其催化區的大小卻基本一致，活性位點(diǎn)的三級結構都是保守區域。Juy M et 等采用x光衍射的方法對熱纖梭菌的Cel D的催化域進(jìn)行了結晶和解析^[4]。結果表明，內切酶的活性位點(diǎn)位于一個(gè)開(kāi)放的“裂縫”（Cleft）中，可與纖維素鏈的任何部位結合并切斷纖維素鏈；外切酶的活性位點(diǎn)位于一個(gè)長(cháng)“環(huán)”（1oop）所形成的“內部通道”（tunnel）里，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。細菌的外切酶有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，有限酶切時(shí)，可將CBD和連接橋分別切去。Meinke A 等利用蛋白質(zhì)工程的方法將糞堿纖維單胞菌的外切酶Cbh A分子的Loop刪除后，發(fā)現該酶的內切酶活性提高^[5]。根據其氨基酸序列的相似性已知的纖維素酶的CD可分為70多個(gè)家族，在同一家族內具有相似的分子折疊模式和保守的活性位點(diǎn)，因此在同一家族內，其反應機制和對底物的特異性都可能相同，這已通過(guò)實(shí)驗得到證實(shí)。

6.2  纖維素結合結構域（CBD）

許多纖維素酶主要依靠在肽鏈N端或C端的CBD結合底物，該結構又稱(chēng)纖維素結合模塊，其功能是將相鄰的催化結構域傳遞到晶體纖維素底物上。細菌纖維素酶的CBD由100-110個(gè)氨基酸組成，同源性較低。細菌CBD平坦的表面只露出2個(gè)或3個(gè)芳香族氨基酸殘基和一些形成氫鍵的殘基,多項研究證實(shí)，這些殘基與CBD對結晶纖維素的結合有關(guān)。一些細菌的CBD結構有一定的共同特點(diǎn)：帶電荷氨基酸含量很低；羥基氨基酸含量很高；都含有Trp、Asn和Gly，而且兩個(gè)Cys在N、C末端的位置完全相同。汪天虹等用多維核磁共振和X射線(xiàn)衍射技術(shù)，證實(shí)了族Ⅱ C. Fimi Cex、Cen以及族Ⅲ C．thermocelhun Cip的CBD有相似的結構：由2個(gè)β片層面對面折疊在一起，形成一個(gè)β三明治結構，CBDcex含有一個(gè)單一的二硫橋連接N-末端和C-末端，CBDcip有一個(gè)Ca2+的高親和性結合位點(diǎn)^[6]。然而，有的CBD的作用似乎不在于跟底物結合，而是破壞晶體纖維素鏈間的非共價(jià)相互作用；或者不僅結合底物，還提供結合不同底物結構的優(yōu)先權。楊永彬等通過(guò)實(shí)驗證實(shí)家族Ⅱ的CBD能夠促使纖維素中氫鍵的斷裂,從而釋放單根纖維素分子鏈^[7]。C.fimi的 CenA或Cex單獨的CBD不具備對纖維素的水解活力，但能破壞棉纖維，形成短纖維，具有疏解結晶纖維素的能力。實(shí)驗證明，細菌纖維素酶中的CBD對酶的催化活力是非必需的，但它們具有調節酶對可溶性和非可溶性底物專(zhuān)一性活力的作用。

6.3  連接橋（1inker）

連接肽（1inker）一級結構的研究發(fā)現，細菌纖維素酶分子的連接肽富含脯氨酸（Pro）和絲氨酸（Thr），完全由Pro-Thr這樣的重復序列約100多個(gè)氨基酸殘基組成。在高級結構的分子形狀上，細菌連接肽、CD、CBD之間呈135o。連接肽的作用可能是保持CD和CBD之間的距離，有助于不同酶分子間形成較為穩定的聚集體。

6.4  細菌纖維素酶關(guān)鍵氨基酸殘基

     運用定點(diǎn)誘變技術(shù),以合成的寡核苷酸作誘變物,在已知的核苷酸序列中準確地誘變密碼子中的一個(gè)或數個(gè)堿基,改變組成蛋白質(zhì)的一個(gè)或數個(gè)氨基酸殘基,以確定功能性氨基酸基團,目前對糖基水解酶中第5、6、7、9、45族的催化機制和功能性氨基酸的研究成果較多。

Bacillus sp.的纖維素酶是糖基水解酶族5 中研究較早的纖維素內切酶,結構上具有(α/β)8折疊桶結構, 通過(guò)底物異頭碳原子位的構型保留進(jìn)行催化反應，研究發(fā)現這些高度同源的纖維素酶的酶反應最適pH有較大的差異^[8]。如B .subtili 的BSC為中性纖維素酶, Bacillus sp. N4的NK1為堿性纖維素酶。在堿性環(huán)境下用Asn 和Ser 分別代替NK1 region 5中的Ser287 和Ala296，結果使得NK1 的酶反應pH范圍與BSC的幾乎一致，這表明Ser287 和Ala296 對NK1在堿性環(huán)境的活性起著(zhù)重要的作用。但在酸性范圍內, NK1 region5中的各種氨基酸取代都不影響其酶反應pH 范圍。根據這一發(fā)現，推斷Ser287和Ala296為影響酶反應pH 范圍的功能性氨基酸殘基,并且認為Ser287和Ala296的替代造成了底物吸附位點(diǎn)或催化位點(diǎn)的氫鍵網(wǎng)重組。

C. fimi 纖維素酶Cel6A屬于糖基水解酶族6，結構上具有七股平行鏈組成的β-折疊桶中心結構，通過(guò)底物異頭碳原子位構型轉化進(jìn)行催化反應。對C. fimi Cel6A 的四個(gè)保守Asp 殘基Asp216，Asp252，Asp287, Asp392 的突變研究表明，Asp252 和Asp392分別作為其酸催化劑和堿催化劑，Asp287 對Asp252 起輔助催化作用，Asp216對催化幾乎不影響。Wolfgang DE等對照C.fimi Cel6A 研究了T .fusca Cel6A 的Asp 79 Asp117，Asp 156和Asp265。結果發(fā)現Asp79 對應于C .fimi Cel6A 的Asp 216 卻有很大不同，它不但能提高Asp 117 的pKa，而且對于催化活性也很重要，而且研究還發(fā)現，Asp265Asn 突變株仍然保留野生型酶7 %的活性。這表明Asp265 并不起堿催化劑的作用，這與高度同源的C.fimi Cel6A的實(shí)驗結果顯然不同。

Clostridium . stercorarium CelZ 屬于族9纖維素酶。Riedel 等推斷其催化殘基為Asp84 和Glu447，位于蛋白的N - 末端，取代CelZ 的一個(gè)或兩個(gè)催化殘基,結果完全消除了其對微晶纖維素的攻擊能力,但在水解CMC時(shí), 卻檢測到了Asp84 替代物的內切酶活性，這可能是發(fā)生在CMC 上的羧化作用而引起的“催化拯救”作用造成的，這與族6 纖維素酶的研究情況非常相似。

H .insolens Cel45A是族45纖維素酶的代表, , 通過(guò)底物異頭碳原子位構型的轉化進(jìn)行催化反應,具有很強的除垢功能。對其底物吸附溝的殘基Tyr147 進(jìn)行了研究,誘變動(dòng)力學(xué)分析表明,這一區域的芳香族氨基酸對吸附有很重要的作用。研究發(fā)現其結構由一個(gè)帶有互相連接長(cháng)環(huán)的六鏈桶組成,而且在酶的表面有一個(gè)40Å 的溝，包含催化殘基Asp10 (可能為堿催化劑) 和酸催化劑Asp121。

7  展望

細菌以多酶復合體結構徹底有效降解天然纖維素，纖維小體是研究較多的細菌纖維素酶復合體。纖維小體的作用方式是理解纖維素降解和利用纖維素資源的關(guān)鍵。進(jìn)一步了解纖維小體結構的普遍性，不同來(lái)源的纖維小體的組成同源性和多樣性，纖維小體蛋白質(zhì)之間的相互作用，纖維小體組織結構的形態(tài)發(fā)生等，從而為工程改造纖維小體，利用纖維素資源提供基礎。

提高纖維素酶的分離純化技術(shù)，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程的手段，對它的空間結構作進(jìn)一步的研究，以便更好地了解它的結構、酶學(xué)特性和協(xié)同作用的降解機制，為纖維素酶蛋白質(zhì)分子的改造和設計提供理論基礎。

通過(guò)構建培養和未培養細菌的基因組DNA文庫，篩選到高效的、多樣性的纖維素酶基因，利用體外DNA分子定向進(jìn)化等基因操作技術(shù)，構建適應不同需要的高效工程菌，比如把纖維素酶基因克隆到Z.molis或釀酒酵母中，可以直接利用纖維素轉化生產(chǎn)酒精。

參考文獻

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