微生物法測定青霉素殘留量的研究

【關(guān)鍵詞】  管碟法； 青霉素殘留量； 含量測定

　　Penicillin residue assay by microbiological method   
　　ABSTRACT  Objective  To establish a microbiological method for penicillin residue assay.  Methods The parameters including culture temperature, limit of detection (LOD) of penicillin and the maximum tolerance dose of experimental strain ATCC9341a to streptomycin sulfate were detected by cylinder�瞤late method. Results  The culture temperature was 28℃ and the LOD of penicillin was 0.008 u/ml, and the maximum tolerance dose of experimental strain ATCC9341a to streptomycin sulfate was 60 mg/ml.  Conclusion  This method was sensitive and can be used for penicillin residue assay.
   
　　KEY WORDS  Cylinder�瞤late method;  Penicillin residue;  Assay

　　青霉素類(lèi)藥物仍是目前常用的抗菌藥，但其過(guò)敏反應一直危害著(zhù)患者的身體健康。美國聯(lián)邦法規中指出，若有相互污染的可能性，非青霉素藥品應化驗是否含有微量青霉素；若能測出有微量青霉素存在，則本批藥品不可出售。本文以青霉素標準品，就微生物法測定青霉素殘留量的各影響因素進(jìn)行了研究探討，建立了測定青霉素殘留量的微生物法。該方法靈敏度高，可用于青霉素殘留量的測定。

　　1  試劑與材料

　　1.1  試劑
   
　　ChPⅡ培養基，USPⅠ培養基，1% pH6.0磷酸鹽緩沖液，1000u/ml青霉素酶溶液，藤黃八疊球菌ATCC9341a，0.9%的氯化鈉溶液，青霉素標準品。

　　1.2  儀器與用具
   
　　生化培養箱(15～40℃)，超凈工作臺，鋼管，鋼管放置器，培養皿。

　　2  試驗方法

　　2.1  菌液的制備
   
　　將工作用菌種ATCC9341a的斜面培養物，接種于USPⅠ號培養基斜面，32～35℃培養24h，用0.9%的氯化鈉溶液洗滌，用前用0.04u/ml的青霉素標準液標定，每100ml培養基中加菌量所致抑菌圈直徑15～18mm為宜。

　　2.2  雙碟平板的制備
   
　　向已熔化并放置40～50℃的培養基中加入適量ATCC9341a菌液，搖勻。取菌液10ml，加入已滅菌的雙碟中，待培養基凝固后，于每個(gè)雙碟中放入4枚小鋼管。

　　2.3  培養基及培養溫度的選擇
   
　　精密稱(chēng)取青霉素標準品15～20mg，用1% pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋至0.04u/ml的標準溶液，分別用ChPⅡ培養基，USPⅠ培養基制備雙碟平板，滴碟后室溫放置1～2h，分別于28和37℃恒溫培養16～18h，測定抑菌圈直徑。

　　2.4  培養溫度對青霉素最低檢測限的影響
   
　　精密稱(chēng)取青霉素標準品15～20mg，用1% pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋為0.015、0.01、0.08和0.007u/ml。用“2.3”中選出的最佳培養基(ChPⅡ)制備雙碟平板，每個(gè)濃度至少滴加10個(gè)鋼管，滴碟后室溫放置1～2h，分別于28和37℃恒溫培養16～18h，測定抑菌圈直徑，計算平均值。

　　2.5  試驗用菌種ATCC941a對硫酸鏈霉素的最大耐受量等條件進(jìn)行研究
   
　　精密稱(chēng)取硫酸鏈霉素250、300和350mg分別加入4ml 1% pH6.0磷酸鹽緩沖液和1ml青霉素酶溶液(1000u/ml)，使成為70、60和50mg/ml的硫酸鏈霉素溶液，用ChPⅡ培養基制備雙碟平板，滴碟后室溫放置1～2h，分別于28和37℃恒溫培養16～18h，測定抑菌圈直徑，計算平均值。

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　　2.6  樣品中青霉素最低檢測限的確定
   
　　精密稱(chēng)取硫酸鏈霉素樣品適量，用1% pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)�加�?/SPAN>1u/ml青霉素標準溶液使成為下列幾種濃度的溶液：
   
　　溶液A：含50mg/ml硫酸鏈霉素并含0.015u/ml青霉素；
   
　　溶液B：含50mg/ml硫酸鏈霉素并含0.005u/ml青霉素；
   
　　溶液C：含50mg/ml硫酸鏈霉素并含0.004u/ml青霉素。
   
　　用ChPⅡ培養基制備雙碟平板，滴碟后室溫放置1～2h，分別于28和37℃恒溫培養16～18h，測定抑菌圈直徑,計算平均值。

結果

　　3.1  培養基及培養溫度試驗
   
　　結果見(jiàn)表1。

　　3.2  培養溫度與青霉素最低檢測限關(guān)系
   
　　結果見(jiàn)表2。

　　3.3  試驗用菌種ATCC941a對硫酸鏈霉素的最大耐受量
   
　　測試結果見(jiàn)表3。

　　3.4  樣品中青霉素最低檢測限的確定
   
　　結果見(jiàn)表4。

　　4  結論與討論
   
　　(1)ChPⅡ培養基與USPⅠ培養基均可使用，但培養溫度在28℃比37℃擴散效果好。
   
　　(2)青霉素的最低檢測限在28℃下為0.008u/ml，在37℃下為0.015u/ml，FDA資料顯示在26～30℃培養，最低檢測限為0.01u/ml。檢驗過(guò)程中適當
       
　　表1        培養基及培養溫度的試驗結果　略
   
　　表2    培養溫度及青霉素最低檢測限的研究結果　略
   
　　表3    試驗用菌種ATCC941a對硫酸鏈霉素的最大耐受量的測試結果　略

　　表4      樣品中青霉素最低檢測限的確定結果　略
   
　　(3)FDA資料中給出的ATCC941a對硫酸鏈霉素的最大耐受量為50mg/ml，本文給出ATCC941a對硫酸鏈霉素的最大耐受量為60mg/ml。
   
　　(4)結果表明此方法靈敏度高，可用于測定青霉素殘留量。

【參考文獻】
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