支原體污染的特點(diǎn)及檢驗

    支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀(guān)察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。

    支原體代謝需固醇類(lèi)物質(zhì)、部分種類(lèi)需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

    支原體污染細胞后。培養液可不發(fā)生混濁。多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著(zhù)，細微變化也可由于傳代、換液而緩解。因此易被忽視。但個(gè)別嚴重者，可致細胞增殖緩慢。甚至從培養器皿脫落。

為確定有無(wú)支原體污染可做如下檢測：

①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養瓶?jì)鹊纳w玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀(guān)察。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含有的DNA著(zhù)色，染色后用熒光顯微鏡觀(guān)察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長(cháng)滿(mǎn)前取出玻片，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用1:3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀(guān)察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速。也可以利用透射電鏡。

④DNA分子條文檢查或支原體培養等方法：檢出率高。但方法較為復雜

    支原體是一類(lèi)缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著(zhù)色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長(cháng)，營(yíng)養要求比細菌高。

    細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。在細胞培養中支原體感染發(fā)生率達到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過(guò)可視法對其進(jìn)行檢測，而且它對細胞的生長(cháng)率影響較小，不易引起注意。國內外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽支原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見(jiàn)的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類(lèi)是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。
    支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實(shí)驗器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細胞的原始組織或器官的污染。

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