生活污水（含藥廠(chǎng)廢水）的細菌學(xué)檢查

1. 學(xué)習水樣的采取方法和水樣中細菌總數測定的方法

2了解水源水的平板菌落計數的原則

3.了解PCR技術(shù)監測污染水體大腸埃希菌的意義和基本原理

4．掌握PCR操作技術(shù)

實(shí)驗材料：

1．培養基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。

2．材料 水樣

3．儀器及其他用具

恒溫培養箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養皿，移液器（1mL），移液管（1mL），試管等，PCR儀，水浴鍋，培養箱，電泳儀，自動(dòng)微量移液器（各型號），濾膜，PCR管，離心管，Whatman 3MM濾紙或相當產(chǎn)品。

4. 試劑及溶液

含有適當抗菌素的LB培養基，Taq DNA聚合酶，正向引物(20 mmol/L）及反向引物(20mmol/L）溶于水中，DNA分子量標準，乙酸銨（l0mol/L），無(wú)水乙醇，    TSEL (50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20%蔗糖，50mmol/L EDTA，1 mg/ml溶菌酶），    SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL蛋白酶K)，    TE緩沖液，l0×擴增緩沖液(500mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，15mmol/L，MgC1₂）。

    4種dNTP貯存液（20mmol/L，pH8.0 )，瓊脂糖溶液(0.7%），電泳緩沖液(1×TAE)，溴化乙錠染色液，6×凝膠上樣緩沖液。

實(shí)驗原理：

本實(shí)驗采用平板菌落計數技術(shù)測定水中細菌總數。由于水中細菌種類(lèi)繁多，它們對營(yíng)養和其他生長(cháng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長(cháng)繁殖。因此，以一定的培養基平板上生長(cháng)出來(lái)的菌落計算得到的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基測定水中細菌總數。

大腸埃希菌（Escherichia coli )是指示糞便污染的重要指示物。當水體中出現大量的E. coli就說(shuō)明近期內水體受到了糞便污染（因其脫離寄主后，其半存留期會(huì )大大縮短）。PCR檢測這種微生物非常靈敏，即使每100mL水中只有一個(gè)個(gè)體，也能被檢驗出來(lái)。

實(shí)驗內容：（一）細菌總數測定

自來(lái)水

(1)用滅菌移液管或移液器吸取lmL水樣，注入滅菌培養皿中。

(2)分別傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，并立即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養基充分混勻。

(3)另取一空的滅菌培養皿，傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基15mL，作空白對照。

(4)培養基凝固后，倒置于37℃溫箱中，培養24h，進(jìn)行菌落計數。兩個(gè)平板的平均菌落數即為lmL水樣的細菌總數。

池水、河水或湖水等

(1)稀釋水樣：取3個(gè)滅菌空試管，分別加入9mL滅菌水。取lmL水樣注入第一管9mL滅菌水內、搖勻，再自第一管取lmL至下一管滅菌水內，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10^-1，10^-2與10^-3。稀釋倍數看水樣污染程度而定，以培養后平板的菌落數在30~300個(gè)之間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數均多到無(wú)法計數或少到無(wú)法計數，則需繼續稀釋或減小稀釋倍數。一般中等污染水樣，取10^-1，10^-2,10^-3三個(gè)連續稀釋度，污染嚴重的取10^-2，10^-3，10^-4三個(gè)連續稀釋度。

(2)自最后三個(gè)稀釋度的試管中各取1mL稀釋水加入空的滅菌培養皿中。每一稀釋度做兩個(gè)培養皿。

(3)各傾注15mL己融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，立即放在桌上搖勻。

(4)凝固后倒置于37℃培養箱中培養24h.。

菌落計數方法

(1)  先計算相同稀釋度的平均菌落數。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(cháng)時(shí)，則不應采用，而應以無(wú)片狀菌苔生長(cháng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數。

(2)  選擇平均菌落數在30~300之間的，當只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數。

(3)  若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數均在30~300之間，則按兩者菌落總數之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應采取兩者的平均數；若大于2，則取其中較小的菌落總數。

(4)  若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數。

(5)  若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數。

(6)  若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，則以近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數。

（二）應用PCR技術(shù)監測污染水體大腸埃希菌

1．水樣的處理及模板DNA的制備

(1)  取水樣lmL，低速(2 000 r/min )離心5min，以除去不溶性雜質(zhì)。取出上清，經(jīng)6 000 r/min離心5min，收集菌體。

(2)  將菌體懸于100 mlTSEL溶液中，置37℃水浴作用30 min。

(3)  向反應混合物中加入300ml SSK溶液，置37℃繼續作用60 min。

(4)  向反應混合物中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻后置-20℃，2h. 12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，室溫晾干后將沉淀物溶于100~300ml無(wú)菌去離子水或TE緩沖液中備用。

如果是純培養的菌落，即將菌落挑入100ml無(wú)菌去離子水中，加熱煮沸1min，即可作為PCR模板。

2．引物設計

    本實(shí)驗的引物來(lái)自E. coli的lac Z和lam B基因。

 lac Z引物1：ZL-1675（5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3'）

 引物2：ZR-2025（5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3'）

lam B引物1：BL-4910(5'-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3'）

引物2：BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3'）

3．PCR擴增體系

    按以下次序，將各成分加在0.5mL PCR薄壁管內混合：

        l0×擴增緩沖液5ml

        20mmo1/L 4種dNTP混合液（pH8.0）1ml

        20mmo1/L正向引物2.5ml

        20mmo1/L反向引物2.5ml

        模板DNA 5~10ml

        Taq DNA聚合酶1~2單位

        補足H₂O至總體積50ml

4．PCR循環(huán)

按以下方法進(jìn)行PCR擴增，典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）。依擴增產(chǎn)物大小與引物堿基組成來(lái)確定時(shí)間與溫度。時(shí)間與溫度會(huì )影響到產(chǎn)物的特異性。具體參數需摸索。

5．擴增產(chǎn)物的檢測和分析

 如果擴增產(chǎn)物大小與其他非特異性DNA片段相差很大，則可直接電泳，通過(guò)大小來(lái)判斷；如果擴增產(chǎn)物中有特異性限制酶切位點(diǎn)，則酶切后電泳，由其大小來(lái)判斷。

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