植物組培中原生質(zhì)體培養

植物原生質(zhì)體是去掉纖維素外壁的具有生活力的裸細胞原生質(zhì)體仍然具有全能性，在適宜的條件下，可經(jīng)過(guò)離體培養得到再生植株。至今已從煙草、胡蘿卜、矮牽牛、茄子、番茄等70多種植物的原生質(zhì)體再生成完整的植株。

原生質(zhì)體培養在應用研究和基礎研究上具有重要意義。第一，與完整植物細胞相比，原生質(zhì)體易于攝取外來(lái)的物質(zhì)，如DNA，染色體、病毒、細胞器、細菌，因此可利用其作為理想的受體系統進(jìn)行各種遺傳操作，在植物遺傳育種實(shí)踐方面意義重大。第而，由于沒(méi)有細胞壁，有利于進(jìn)行體細胞誘導融合和單細胞培養。第三，可用于細胞表面的結構與功能的研究，細胞器結構與功能的研究，病毒侵染與復制機理的研究，以及細胞核與細胞質(zhì)相互關(guān)系，植物生長(cháng)物質(zhì)的作用、植物代謝等生理問(wèn)題的研究。

原生質(zhì)體培養的基本方法包括：材料的選擇與處理、原生質(zhì)體的分離、純化、培養、誘導愈傷組織和再生植株。

①材料選擇    目前，人們已從多種植物材料中成功分離出植物的原生質(zhì)體，如葉片、花瓣、子葉、下胚軸、幼根、莖葉、愈傷組織、懸浮細胞等，其中植物原生質(zhì)體最方便和最普遍的來(lái)源是葉片，葉片中的葉肉組織是游離原生質(zhì)體的一種經(jīng)典材料。它來(lái)源方便，供應及時(shí)，當有明顯的葉綠體存在時(shí)也便于在細胞融合中識別。

②材料預處理   預處理不僅可以提高植物細胞的滲透壓，以減少高滲環(huán)境的影響，還可以使分離的原生質(zhì)適應培養條件，提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和代謝活性等。材料預處理的方法主要有黑暗培養、低溫處理、預質(zhì)壁分離等。

①機械分離法    首先使稀薄啊發(fā)生質(zhì)壁分離，然后用利刃切開(kāi)細胞壁釋放出原生質(zhì)體。此法的主要缺點(diǎn)是：一是原生質(zhì)體的產(chǎn)量很低、方法繁瑣費力；而是分生組織和液泡化程度不高的細胞不適用。其優(yōu)點(diǎn)是可避免酶制劑對原生質(zhì)體的有害影響。

②酶解分離法   植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)等，細胞之間通過(guò)果膠質(zhì)相連接。酶法分離就是用相應的酶制劑將上述物質(zhì)分解，以達到分離原生質(zhì)體的目的。常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、蝸牛酶等。

a、配制酶液。  在原生質(zhì)體分離時(shí)細胞壁一旦去除，裸露的原生質(zhì)體若處于內外滲透壓不同的條件下，就可能破裂。因此在酶液中必須加滲透壓穩定劑，常用的滲透壓穩定劑有糖溶液系統和鹽溶液系統兩種。

b、分離原生質(zhì)體。  原生質(zhì)體分離有兩種方法。一種是兩步分離法，首先把植物材料在果膠酶或離析酶內處理一定時(shí)間，使單個(gè)細胞分離出來(lái)，然后再在纖維素酶中除去細胞壁，最后獲得原生質(zhì)體；另一種是一步分離法，即把一定量的纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶組成 混合酶液，對材料進(jìn)行一次性處理，得到分離的原生質(zhì)體。

經(jīng)酶解處理后得到一個(gè)由原生質(zhì)體、細胞團和細胞碎片組成的混合液，需要進(jìn)一步純化。常用的純化方法有：

a、離心沉淀法   利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先行過(guò)濾再低速離心，使原生質(zhì)體沉淀于試管底部。該方法比較簡(jiǎn)單，由于原生質(zhì)體沉淀在一起相互擠壓，常引起原生質(zhì)體破碎。

經(jīng)酶液處理的原生質(zhì)體懸浮液用400目網(wǎng)篩過(guò)濾后，濾液經(jīng)500~1000r/min離心5~6min吸去上清液，用一般洗滌液（如一定濃度的甘露醇）或專(zhuān)用洗滌液（0.45mol/L甘露醇，10mmol/L CaCl₂.H₂O,0.7mmol/L KH₂PO₄,pH5.6）重新懸浮離心，如此重復2~3次。最后收集沉積于試管底部的原生質(zhì)體。

b、漂浮法   應用滲透劑含量較高的高滲溶液使原生質(zhì)體漂浮于液面。該方法能夠獲得比較純凈的原生質(zhì)體；由于存在高滲溶液對原生質(zhì)體的破壞作用，僅能獲得少量的完好原生質(zhì)體。

首先依照離心沉淀收集原生質(zhì)體，之后將沉淀用洗滌液（3%蔗糖、0.4mol/L甘露醇、1480mg/L CaCl₂.2H₂O）或用11%~23%蔗糖液洗滌離心（400~800r/min,3~10min）2~3次，收集漂浮在溶液表面的原生質(zhì)體，最后用培養液洗滌一次。

c、界面法   采用兩種比重不同的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體即處于兩種溶液界面之間。該方法可防止因擠壓引起原生質(zhì)體破碎，原生質(zhì)體收獲量較大。

首先依沉淀法收集原生質(zhì)體，再用培養液離心沉淀一次，將沉淀置于2~3ml培養液中懸浮。取10ml離心管加入8ml 18%的蔗糖溶液，再取2ml原生質(zhì)體懸浮液鋪于其上，以700r/min離心2min，此時(shí)大量原生質(zhì)體集中于培養液與蔗糖溶液之間，輕輕吸取原生質(zhì)體，再用培養液離心洗滌一次，即可獲得純凈的原生質(zhì)體。

分離純化后的原生質(zhì)體需要檢查活力并調整好起始密度后才能進(jìn)行培養。對于新分離出來(lái)的原生質(zhì)體的活力有以下幾種測定方法。

①形態(tài)識別。形態(tài)上完整，富含細胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體有活力。若將形態(tài)上正常的原生質(zhì)體放入低滲洗液或培養基中，可見(jiàn)到分離時(shí)縮小的原生質(zhì)體又恢復原態(tài)。一般正常膨大的原生質(zhì)體都是有活力的原生質(zhì)體。

②活體染色。用0.1%酚番紅或Evans藍進(jìn)行染色后即進(jìn)行觀(guān)察，有活力而質(zhì)膜完整的原生質(zhì)體對染料有排斥作用而不被染色，死亡的原生質(zhì)體能立即被染上色。

③熒光染料活體染色。用雙醋酸鹽熒光素（FAD）對原生質(zhì)體進(jìn)行染色，染料可自由透過(guò)原生質(zhì)體質(zhì)膜進(jìn)入內部，進(jìn)入后由于受到原生質(zhì)體內酯酶的分解，而產(chǎn)生有熒光的極性物質(zhì)熒光素，它不能自由出入質(zhì)膜，并在膜內堆積。在熒光顯微鏡下可根據產(chǎn)生的熒光，判斷原生質(zhì)體的活力。

①淺層液體培養   此法是將一定密度（約2Χ10⁵個(gè)/ml）的原生質(zhì)體懸浮液移到培養皿或三角瓶中使之形成一個(gè)淺層（1mm）并進(jìn)行培養。注意液層不宜太厚，否則不利于細胞對氧的吸收。培養期間每日需輕輕搖動(dòng)2-3次，避免分布不均勻并幫助通氣。本法的優(yōu)點(diǎn)是培養基與空氣接觸面大，通氣好，原生質(zhì)體的代謝物是易擴散，防止了有害物質(zhì)積累過(guò)多而造成毒害。此外，轉移培養物或添加新鮮培養基也方便，并便于觀(guān)察和照相。

②平板法培養   將1ml原生質(zhì)體密度為4Χ10⁵個(gè)/ml的懸浮液，與等體積已溶解的含有1.4%瓊脂糖的培養基（40~45℃）均勻混合后，置于直徑為6cm培養皿中，此時(shí)密度為2Χ10⁵個(gè)/ml，待凝固后，將培養皿反轉，置于四周墊有保濕材料的直徑為9cm的培養皿內。此法得到的原生質(zhì)體分布均勻，有利于進(jìn)行定點(diǎn)觀(guān)察原生質(zhì)體形成細胞壁和細胞團的全過(guò)程。

③雙層培養法   為固體培養和液體淺層培養相結合的培養方法。在培養皿內注入適量的固體培養基，再加入與原生質(zhì)體混合均勻的培養液。此法既具有較豐富的培養基，又不易干枯,并且細胞分裂后可在固體培養基上生長(cháng)和繁殖.

①細胞壁的再生   分離的健康原生質(zhì)體在各方面條件都合適的時(shí)候,會(huì )很快再生出新的細胞壁.因植物種類(lèi)、取材的器官或組織的不同，細胞壁開(kāi)始再生的時(shí)間也不同。一般情況下，由培養細胞和幼嫩組織分離的原生質(zhì)體，再生壁開(kāi)始再生的時(shí)間也不同。一般情況下，由培養細胞和幼嫩組織分離的原生質(zhì)體，再生壁開(kāi)始得比較早，而對于葉肉原生質(zhì)體，則需要較長(cháng)的時(shí)間才能再生出新的細胞壁。

②植株再生   當原生質(zhì)體形成新細胞壁后，就進(jìn)入細胞分裂階段，持續分裂的結果就形成細胞團或愈傷組織。由細胞團或愈傷組織再生成完整植株可以通過(guò)兩條途徑來(lái)完成，一是愈傷組織誘導形態(tài)發(fā)生；另一途徑是由植株原生質(zhì)體細胞系在培養過(guò)程中直接誘導形成胚狀體，并且可以繼續形成極性，即下端生根、上端分化芽，從而發(fā)育成完整植株。

當原生質(zhì)體再生的愈傷組織長(cháng)到1-5mm時(shí)，可以轉接到分化培養基上。分化培養基與原生質(zhì)體培養基的區別在于：不加滲透壓穩定劑，只加蔗糖做碳源；提高細胞分裂素的濃度，降低生長(cháng)素濃度。在分化培養基產(chǎn)生的苗一般沒(méi)有根，需轉接到生根培養基中以促進(jìn)根的形成。

原生質(zhì)體融合是指兩種異源原生質(zhì)體，在一定的條件下相互接觸，發(fā)生膜融合、細胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞，進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的過(guò)程，也稱(chēng)體細胞雜交。原生質(zhì)體融合不僅可以克服植物種屬以上的有性雜交不親和性障礙，進(jìn)行遺傳改良，同時(shí)也為細胞生物學(xué)和遺傳學(xué)研究提供了一個(gè)新途徑。

原生質(zhì)體的融合方式有自發(fā)融合和誘導融合兩類(lèi)。自發(fā)融合是種內融合，融合率不高，融合的個(gè)體一般不能進(jìn)一步發(fā)育。誘導融合是指加入誘導劑或用其他方法使二親本原生質(zhì)體融合，它可以是種內的，也可以是種間，甚至屬間或科間以上的。人工誘導融合的方法有化學(xué)融合法和物理融合法兩種。

①化學(xué)融合法    主要是用各種化學(xué)試劑作為誘導劑，常用的方法有高鈣高PH法，聚乙二醇（PEG）法。

a、高鈣高PH法。這是比較早采用的融合方法，它是以較高濃度的Ca²⁺作為融合劑，誘導原生質(zhì)體融合。用PH為10.5、Ca²⁺濃度為50mmol/L的溶液，在37℃的條件下誘導兩個(gè)煙草品系葉肉原生質(zhì)體的融合，獲得了種間雜種細胞。

b、PEG法。1974年高國楠和Michayluk用PEG誘導融合植物細胞，使原生質(zhì)體融合的頻率明顯提高。以后又將PEG誘導與高鈣高PH溶液相結合，可以顯著(zhù)地提高融合率，有的可高達30%~40%。具體方法是：首先制備兩個(gè)不同來(lái)源的植物原生質(zhì)體，按要求的比例1：1到1：4在含滲透穩定劑和鈣鹽的溶液內相混合，然后加入23%~30%PEG，促使原生質(zhì)體迅速廣泛凝聚，形成團塊。然后開(kāi)始洗滌，先加入堿性高鈣溶液，接著(zhù)用培養基洗滌PEG。當PEG被稀釋和被洗滌除去時(shí)，發(fā)生了融合，而融合產(chǎn)物和原生質(zhì)體又恢復成球形，轉移到培養基中培養即可。

②物理融合法  主要包括顯微鏡操作、離心或振動(dòng)、電刺激等來(lái)促進(jìn)原生質(zhì)體融合。

如微電極法誘導融合是通過(guò)插入微電極接通一定的交變電場(chǎng)，原生質(zhì)體極化后在電場(chǎng)中順著(zhù)電場(chǎng)排列成緊密接觸的珍珠串狀。此時(shí)瞬間施以適當強度的電脈沖，使原生質(zhì)體膜被擊穿而發(fā)生融合。此法基本解決了化學(xué)誘導融合劑的毒性問(wèn)題，具有融合效率高，重復性好，方法簡(jiǎn)單，對原生質(zhì)體傷害小等特點(diǎn)。

雙親原生質(zhì)體融合時(shí)，可分為自體融合和異體融合兩大類(lèi)。自體融合的結果得到同核體，由不同雙親、原生質(zhì)體融合得到異核體。與同核體相比，融合后的異核體在人工培養基上分裂分化并不占優(yōu)勢。通常由于啟動(dòng)分裂和持續分裂緩慢，而受到同核體的抑制，不能發(fā)育成為雜種植株。所以必須建立或設計出一套方法，優(yōu)先選擇細胞雜種植株。目前，細胞雜種選擇方法主要有互補選擇法、機械分離雜種細胞法和雙熒光標記選擇法。

①互補選擇法

a、白化互補選擇法。該法利用一個(gè)葉綠素缺失突變體進(jìn)行篩選。Cocking（1972）利用白化矮牽牛在限定培養基上細胞分裂、分化成植株，正常矮牽牛在此限定培養基上細胞不能分裂，融合后形成的雜種細胞，在限定培養基上可以通過(guò)細胞分裂和分化進(jìn)行選擇。Melchers(1974)將兩種突變白化苗的細胞經(jīng)融合互補后產(chǎn)生綠苗選擇到曼佗羅、矮牽牛、煙草等的種間體細胞雜種。此法可以依賴(lài)有性雜交知識，可廣泛用于不同親緣關(guān)系的融合。

b、營(yíng)養缺陷型互補選擇法。借助于營(yíng)養缺陷突變型進(jìn)行體細胞雜種的互補選擇。有人用煙草抗氯酸鹽突變型和不能利用硝酸鹽（缺乏硝酸還原酶）的突變型，將兩個(gè)不同突變型的原生質(zhì)體融合起來(lái)，并把其培養在僅以硝酸鹽作氮源的培養基上，選出了大量雜種體細胞。此法簡(jiǎn)單而準確，但不易找到合適的缺陷型親本。

c、抗性互補選擇法。利用原生質(zhì)體對藥物的不同抗性也用于互補選擇雜種。例如，爬山虎的原生質(zhì)體在MS培養基上一般不會(huì )超過(guò)50個(gè)細胞就停止生長(cháng)，而矮牽牛的原生質(zhì)體卻能在MS培養基上正常分裂分化。但二者對放線(xiàn)菌素的反應又不同，矮牽牛細胞在10μg/L放線(xiàn)菌素D即敏感，爬山虎對其抗性較強。于是在含有10μg/L放線(xiàn)菌素D的MS培養基中，雙方親本都被抑制生長(cháng)，而只有雜種細胞能夠進(jìn)行正常的分裂分化。

②機械分離雜種細胞法    該法就是通過(guò)顯微鏡操作的手段直接取出異核體。常用的是含有葉綠體其他色素質(zhì)體的組織細胞，另一方則選用懸浮培養的或固體培養的細胞，不含其他色素。在異源原生質(zhì)體融合后能明顯識別。融合一旦發(fā)生便馬上可檢出其融合產(chǎn)物。具體方法是利用兩種原生質(zhì)體形態(tài)色澤上的差異，在融合處理后分別接在帶有小格的“Cu-park”培養皿中，每個(gè)小格中約有2-3個(gè)原生質(zhì)體。在顯微鏡下可以找出異源融合體，標志位置長(cháng)大后轉移到培養皿中培養，測定染色體的變化，比較同工酶的差異等。此法對原生質(zhì)不要求特殊遺傳背景，得出的結果可信度最大。但在技術(shù)操作上難度最大。

③雙熒光標記選擇法   Patnik和Coking等1982年在進(jìn)行原生質(zhì)體融合時(shí)，親本一方是懸浮細胞來(lái)的原生質(zhì)，因其沒(méi)有葉綠體，有異硫氰酸熒光素（FITC）標記時(shí)會(huì )發(fā)出“蘋(píng)果綠”熒光；另一親本是含有葉率體的葉肉細胞，會(huì )發(fā)紅光。二者形成的異核體（雜種細胞）在熒光顯微鏡下會(huì )同時(shí)發(fā)出蘋(píng)果綠熒光和紅光熒光，因此可方便地把雜種細胞分揀出來(lái)，加以培養。

（3）雜種植株的鑒定

①形態(tài)學(xué)鑒定   這種方法是鑒定雜種的最準確的方法。因為要在形態(tài)上表現出雜種性來(lái)，就必須有內部的大量基因的協(xié)調活動(dòng)，而且基因的活動(dòng)必須和細胞的活動(dòng)取得了協(xié)調。但經(jīng)愈傷組織途徑再生植株與原生質(zhì)融合產(chǎn)生的變異很難區別，因此僅以來(lái)形態(tài)特征來(lái)判斷不太可靠，尚需配合其他方法。

②細胞學(xué)觀(guān)察   應用染色體計數方法、核型分析和顯帶技術(shù)以親本為對照，對雜種細胞的染色體數目、大小與形態(tài)的變化等進(jìn)行觀(guān)察比較。此法優(yōu)于形態(tài)學(xué)鑒定，對親源關(guān)系遠的雜種細胞的判斷準確性較好。

③同工酶分析  一般以雙方親本的同工酶譜帶作為對照，雜種細胞都具有雙親譜帶的總和。有時(shí)還出現新的譜帶，則說(shuō)明融合產(chǎn)物是異源性的。應用于分析的同工酶很多，已成功使用的有過(guò)氧化物酶、乳酸脫氫酶、脂酶、氨肽酶等。由于植物在不同的發(fā)育階段，在不同的組織中，同工酶譜帶本身可以有較大的差異，因此進(jìn)行這方面的比較時(shí)，應注意取樣的部位和時(shí)間要嚴格一致。

④分子標記鑒定   分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展對于分析體細胞雜種的遺傳構成有重大的促進(jìn)作用。采用核酸分子雜交、限制性?xún)惹忻搁L(cháng)度多態(tài)性（RFLP）和隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分析，將使鑒定結果更精確。