通過(guò)控制培養和培養條件進(jìn)行分離工業(yè)微生物產(chǎn)生菌

各種微生物對營(yíng)養要求和培養條件是不同的，在分離篩選時(shí)若在這兩個(gè)方面加以調節控制，就能獲得更好的分離效果。

1.培養基的營(yíng)養成分

各種微生物對碳源、氮源要求各異，有的對營(yíng)養還有特殊的要求，事先了解被分離微生物的營(yíng)養要求，從而設計一個(gè)合理快速的分離培養基，能夠收到事半功倍的效果。

放線(xiàn)菌是生產(chǎn)抗生素和酶制劑的重要來(lái)源。在選擇分離放線(xiàn)菌時(shí)，通常采用改良的HV瓊脂培養基、土豆-胡蘿卜水汁液培養基和淀粉瓊脂培養基能取得較好的效果。但不同菌種對營(yíng)養要求差別很大，如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養基即可分離到，而以色列放線(xiàn)菌則在有CO₂存在且有適宜培養基的情況下才能正常生長(cháng)繁殖。

篩選水解酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常利用以底物為惟一碳、氮源的平板進(jìn)行分離，如以淀粉為碳源的培養基可鑒定菌落能否產(chǎn)生淀粉酶；一種含纖維素粉為碳源的分離培養基，可以鑒別纖維素酶產(chǎn)生菌；用含有酪蛋白為有機氮源的平板培養基，可以鑒別蛋白酶的產(chǎn)生菌。純種分離時(shí)，把以上瓊脂平板置于適宜的溫度培養一定的時(shí)間，如具有產(chǎn)生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根據圈的大小可初步判斷酶活力強弱。測定水解圈直徑與菌落直徑之比，把比例大的菌落移入斜面保藏，供進(jìn)一步篩選。

2.培養基的pH

細菌、放線(xiàn)菌的生長(cháng)繁殖對pH一般要求偏堿，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此，分離培養基的pH應該調節到被分離微生物要求范圍。這不僅有利于自身生長(cháng)，也可排除一部分不需要的菌類(lèi)。例如，分離檸檬酸產(chǎn)生菌的黑曲霉，就是利用調節培養基的酸堿度獲得成功的。其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸10%～20%配成培養液，調節pH2.0～2.5，以一定量的培養基和土樣均勻混合，用毛細吸管點(diǎn)種在平皿內事先覆蓋的無(wú)菌濾紙上（2～3層），于30℃培養，這樣可以分離到產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉。

分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以把培養基調到pH 9～11，在此范圍內不宜生長(cháng)的微生物被抑制，這對分離本身起到濃縮作用。大多數水解酶的生長(cháng)最適pH基本相近，而酶的作用pH未必與產(chǎn)酶pH相同。

培養基的pH要結合營(yíng)養成分和培養條件來(lái)考慮。因為微生物在生長(cháng)繁殖過(guò)程中，由于代謝作用會(huì )產(chǎn)生酸性或堿性產(chǎn)物，pH發(fā)生變化，微生物生長(cháng)受到抑制。一般培養基中碳氮比（C/N）高者，培養后傾向于酸性，反之則傾向于堿性。無(wú)機鹽的性質(zhì)也會(huì )影響pH變化，（NH₄）₂SO₄是生理酸性無(wú)機氮源，其中NH4+被菌體利用，留下SO₄^2-，培養液變成酸性。而NaNO3是生理堿性氮源，其中NO₃^—被菌體分解利用后，剩余Na+，使培養液變成堿性。如發(fā)酵過(guò)程缺氧，則代謝向有機酸合成方向進(jìn)行，pH下降。為了維持培養基的ph，一般要加磷酸鹽，如K₂HPO₄、KH₂PO₄，使培養基具有一定的緩沖能力。如果培養液中的酸堿變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足以調節pH變化，則可適當加入碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸類(lèi)，使培養基的pH能保持在恒定的范圍內。此外，在分離霉菌時(shí)，加幾滴乳酸不僅可以維持一定酸堿度，而且可以抑制細菌的生長(cháng)。

3.排除不需要的菌類(lèi)

采取調節pH的方法來(lái)抑制非目的微生物的生長(cháng)，雖然能起到一定的作用，但并不是對所有的菌類(lèi)都有效。有些細菌和放線(xiàn)菌同樣可以在酸性環(huán)境下生長(cháng)，而個(gè)別的霉菌，也同樣可以在中性或偏堿的培養基中生長(cháng)。為了更有效地抑制非目的微生物的生長(cháng)，要加入一些專(zhuān)一性的抑制劑。

（1）分離細菌時(shí)，在培養基中加入濃度為50U/ml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生長(cháng)。

（2）分離放線(xiàn)菌時(shí)，在樣品中加入0.05%十二烷基磺酸鈉（SDS）不僅可以抑制細菌的生長(cháng)，還能激活放線(xiàn)菌孢子的萌發(fā)。加入氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制細菌和真菌，而不影響放線(xiàn)菌的生長(cháng)。

（3）分離霉菌和酵母菌時(shí)，在培養基中加入青霉素、鏈霉素和四環(huán)素各30U/ml，可以抑制細菌和放線(xiàn)菌生長(cháng)。

（4）分離根霉和毛霉時(shí)，由于這些微生物的菌絲易蔓延成片，難以得到純化的菌落，通常在培養基中添加0.1%去氧膽酸鈉或山梨醇防止菌絲蔓延，使菌落長(cháng)得小而緊密。

一般用于分離單一目的微生物的培養基中均含有抑制其他微生物的抑制劑，這些專(zhuān)用的抑制劑在小型實(shí)驗室配制較麻煩，現已有成品供應，只要直接加入基礎培養基即可。如氨芐西林，主要用于分離親水氣單孢菌。

4.控制培養溫度

控制培養溫度，也是一種獲得目的微生物的有效措施。各類(lèi)微生物生長(cháng)溫度不同，從大范圍來(lái)看，可分三大類(lèi)：一類(lèi)是高溫微生物，最適溫度在50～60℃。如果要分離這類(lèi)菌可將分離培養基置于50～60℃溫度下培養，能抑制一些嗜冷、中性微生物生長(cháng)，可以有效地分離到高溫菌類(lèi)。第二類(lèi)是中溫微生物，它們的最適生長(cháng)溫度是20～40℃，超過(guò)50℃，就停止生長(cháng)。這類(lèi)微生物最為常見(jiàn)，、數量都占首位。工業(yè)發(fā)酵微生物絕大多數都屬于此類(lèi)。其中不同類(lèi)群微生物對溫度又有所差別，一般細菌、放線(xiàn)菌最適溫度為25～37℃，霉菌和酵母最適溫度為20～28℃。第三類(lèi)為低溫微生物，它們的最適溫度為15℃或更低。當從樣品中分離各種菌類(lèi)時(shí)，分別置于自身最適溫度下培養也可大體上抑制另一些微生物的生長(cháng)。當分離某些特殊產(chǎn)物的微生物時(shí)，對溫度的選擇還需考慮某些內在的關(guān)系，如在篩選不飽和脂肪酸產(chǎn)生菌時(shí)，由于細胞膜中所含的不飽和脂肪酸含量越高，其凝固點(diǎn)越低，即細胞在較低溫度下仍能表現出活力，因此在低于正常溫度10℃下分離效果最好。

三、厭氣菌的分離

好氣菌要在有氧條件下培養，嫌氣菌要在厭氧狀況下才能生長(cháng)。工業(yè)發(fā)酵所用菌種為厭氣菌的有丙酮丁醇的梭狀芽孢桿菌，白酒增香用的丁酸菌、己酸菌及用于環(huán)境污水處理和水產(chǎn)養殖用的光合菌、反硝化菌、脫氮排硫桿菌等。它們生長(cháng)于水底層及沉積物中，要從樣品中分離這類(lèi)菌，需采取厭氣培養法，否則菌體因接觸氧氣而死亡。因此，培養過(guò)程中要除去氧氣，現介紹如下幾種方法：

（一）加還原劑

分離培養基內加入還原劑，如半胱氨酸、D型維生素C、硫化鈉等，操作時(shí)以最快的速度劃線(xiàn)分離，然后立即置于事先已抽真空密閉的容器內（充CO₂或N₂也可），于室溫培養。

（二）焦性沒(méi)食子酸法

焦性沒(méi)食子酸和NaOH互相反應除去氧氣。操作時(shí)，先將焦性沒(méi)食子酸放在容器中，把含有厭氧菌樣品的培養皿架空放入容器內，然后加入NaOH溶液，立即蓋上蓋子，并用石蠟或凡士林密封，放到室溫下培養。要除去100ml空氣中的氧氣需要焦性沒(méi)食子酸固體1g和10%NaOH溶液10ml。

（三）平皿厭氣培養法

取無(wú)菌培養皿一套，在皿蓋內  到上分離培養基，凝固后，皿底一側放焦性沒(méi)食子酸固體，另一側放10%NaOH溶液，使二者不相接觸。準備完畢，在凝固的瓊脂平板上迅速把含厭氧菌樣品進(jìn)行劃線(xiàn)，然后蓋上皿蓋并密封，搖動(dòng)平皿使焦性沒(méi)食子酸固體和NaOH溶液混合，發(fā)生化學(xué)反應，除去皿內的氧氣，置適宜溫度下進(jìn)行培養。

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