淀粉酶的固定化生產(chǎn)

一、實(shí)驗目的：

學(xué)習細胞固定化的原理，通過(guò)海藻酸鈉包埋固定產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌，掌握菌體包埋固定的基本方法，了解固定化細胞在實(shí)際中的應用。

二、 實(shí)驗原理：

細胞固定化克服了傳統游離細胞發(fā)酵的不足，本實(shí)驗以海藻酸鈉為載體，以CaCl2為交聯(lián)劑，進(jìn)行固定化枯草芽孢桿菌。海藻酸鈉是從海藻提取獲取的藻酸鹽，為D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線(xiàn)性共聚物，多價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2+）可誘導凝膠。

三、 實(shí)驗材料：

1.菌株：枯草芽孢桿菌。

2.發(fā)酵培養基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

3.固定化用培養基：淀粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

四、實(shí)驗步驟：

（1）培養基滅菌：取250mL三角瓶，分別放入配好的液體培養基100ml，滅菌冷卻。

（2）種子活化和接種：將枯草芽孢桿菌接入培養基，30℃培養活化，取活化后的枯草芽孢桿菌分別接入已滅菌冷卻的三角瓶培養瓶，振蕩混勻。

（3）培養：將已接種的三角瓶培養液置于振蕩培養箱，200r/min，25℃培養三天，離心收獲菌體并用無(wú)菌水洗滌一次，制備菌懸液，使其中枯草芽孢桿菌菌數為2.3×107個(gè)/ml。

（4）海藻酸鈉及交聯(lián)劑的制備：

海藻酸鈉溶液的制備：取海藻酸鈉1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分別置于250ml三角瓶中，各加入100ml蒸餾水，放置并攪拌，滅菌。

交聯(lián)劑的制備：配制2%濃度的CaCl2，滅菌。

（5）固定化枯草芽孢桿菌的制備

將枯草芽孢桿菌細胞菌懸液與海藻酸鈉溶液按照1∶1 充分混勻后,用一注射器,將混合液滴入交聯(lián)劑中, 交聯(lián)劑的陽(yáng)離子從外部擴散進(jìn)入海藻酸鈉枯草芽孢桿菌混合液珠內, 將細胞包埋其中。制成凝膠小球，使酵母固定化，用無(wú)菌水洗滌固定化細胞，然后加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。

（6）固定化細胞的增殖：將固定化細胞轉入固定化增殖培養基25℃，pH6下培養。

5 實(shí)驗結果

   利用DNS法檢測培養液中葡萄糖濃度，以確定是否產(chǎn)生了淀粉酶，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養，滴入碘液，看是否有藍色產(chǎn)生。

六、思考題

1、固定化細胞有何優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？

2、對細胞或者酶進(jìn)行固定的方法還有哪些？

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