雙歧桿菌的分離、培養及鑒定

一 實(shí)驗目的

  1、掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。

   2、觀(guān)察雙歧桿菌的形態(tài)特征并了解雙歧桿菌的生長(cháng)特性。

   3、了解雙歧桿菌鑒定的一般方法。

二 基本原理

    厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類(lèi)繁多，其生理作用日益受到人們的重視。雙歧桿菌是專(zhuān)性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，雙歧桿菌的分離、培養及活菌計數的關(guān)鍵是提供無(wú)氧和低氧化還原電勢的培養環(huán)境。

    雙歧桿菌的最適生長(cháng)溫度37℃~41℃，最低生長(cháng)溫度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最適pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生長(cháng)。其細胞呈現多樣形態(tài)，有短桿較規則形、纖細桿狀具有尖細末端形、球形、長(cháng)桿彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形。單個(gè)或鏈狀、V形、柵欄狀排列，或聚集成星狀。革蘭氏陽(yáng)性，不抗酸，不形成芽孢，不運動(dòng)。雙歧桿菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光并具有柔軟的質(zhì)地。雙歧桿菌是人體內的正常生理性細菌，定殖于腸道內，是腸道的優(yōu)勢菌群，占嬰兒消化道菌叢的92%。該菌與人體終生相伴，其數量的多少與人體健康密切相關(guān)，是目前公認的一類(lèi)對機體健康有促進(jìn)作用的代表性有益菌。該菌可以在腸粘膜表面形成一個(gè)生理性屏障，從而抵御傷寒沙門(mén)氏菌、致瀉性大腸桿菌，痢疾致賀氏菌等病原菌的侵襲，保持機體腸道內正常的微生態(tài)平衡；能激活巨噬細胞的活性，增強機體細胞的免疫力；能合成B族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素；能控制內毒素血癥和防治便秘，預防貧血和佝僂��；可降低亞硝胺等致癌物前體的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羥自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化，具有抗衰老功能。

    雙歧桿菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實(shí)驗介紹的是一種簡(jiǎn)便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù)，亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術(shù) 。以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一套完整技術(shù)，而且多年來(lái)的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專(zhuān)性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：預還原培養基制好后，可隨時(shí)取用進(jìn)行試驗；任何時(shí)間觀(guān)察或檢查試管內的菌都不會(huì )干擾厭氧條件。

目前，雙歧桿菌鑒定的方法有很多種。近年來(lái)興起的一種新的RAPD等分子生物學(xué)技術(shù)對雙歧桿菌進(jìn)行基因指紋圖譜的構建，分析不同雙歧桿菌種間存在的同源性和多態(tài)性；RAPD技術(shù)也可用于雙歧桿菌菌種鑒定及分型。一般來(lái)講，我們都應用適合鑒定所有厭氧菌的方法，主要包括雙歧桿菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發(fā)酵試驗和其他相關(guān)指標等。

三 實(shí)驗用具

    高純氮氣   厭氧管  注射器  培養箱   冰塊  水浴鍋   鑷子  記號筆  MRS培養基   細菌生化微量鑒定管  酒精棉球  瓷盤(pán)   振蕩器  銅柱除氧系統  定量加樣器  恒溫水浴  載玻片  顯微鏡  恒溫培養箱  超聲波破碎儀  濾紙  層析缸  酒精燈  封口膜  厭氧罐  等。

四、實(shí)驗方法與步驟

    1 銅柱系統除氧

    銅柱是一個(gè)內部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來(lái)控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來(lái)的氣體如N₂、CO₂ 和H₂等都含有微量O₂，故當這些氣體通過(guò)溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O₂化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏�。當向氧化狀的銅柱通入H₂時(shí)，H₂與CuO中的氧就結合形成H₂O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H₂源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。

    2 預還原培養基及稀釋液的制備

    制作預還原培養基及稀釋液時(shí)，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N₂氣的長(cháng)針頭以排除O₂。此時(shí)可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無(wú)色，說(shuō)明試管內已成為無(wú)氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。

    3 分離

    （1）編號

    取五支無(wú)菌水試管，分別用記號筆標明10^-1、10^-2……10^-5。

    （2）稀釋

    在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10^-1稀釋液。用無(wú)菌注射器吸取1mL10^-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10^-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)��?/SPAN>10^-7，制成不同樣品稀釋液。通常選10^-5、10^-6、10^-7三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計數。

    （3）滾管分離

      a、滾管

    將無(wú)氧無(wú)菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，用無(wú)菌注射器吸取10^-4、10^-5、10^-6三個(gè)稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤(pán)中迅速滾動(dòng)，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會(huì )即刻形成凝固層。

      b、分離

    生成的菌落需挑取出來(lái)，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀(guān)察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開(kāi)試管膠塞，同時(shí)迅速將氣流適當、火焰滅過(guò)菌的氮氣長(cháng)針頭插入管內。同時(shí)，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過(guò)菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養。培養24h或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。

    4 計數并鏡檢

    （1）計數

    液體純培養物經(jīng)系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量。公式如下：

雙歧桿菌數量cfu/g（mL）樣品=0.1mL滾管計數的實(shí)際平均值×10×稀釋倍數

    （2）鏡檢

     挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察菌體形態(tài)。

    5 菌種鑒定

    ⑴ 雙歧桿菌特定酶的檢測

    利用果糖-6-磷酸鹽對分離得到的菌種進(jìn)行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）的測定，初步確定菌種是否為雙歧桿菌屬。F6PPK測定的操作如下：

    ① 將從樣品中分離出的雙歧桿菌培養于厭氧液體改良MRS培養基中37℃生長(cháng)24 h。

    ② 將菌液4400 rpm離心10 min,收集菌體，緩沖液ⅰ洗滌2次，最后溶于約4 mL緩沖液ⅰ中，制成細菌懸液。

    緩沖液

    ⅰ 現用現配。取0.05 M Na₂HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH₂PO₄ 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-鹽酸鹽。

    ③ 用超聲波粉碎儀，400 W條件下；每處理5 s、間隔5 s,超聲粉碎8 min，至菌體溶液呈半透明。

    ④ 破碎后，取0.5 mL 于離心管中，加試劑ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保溫30 min。

    ⅱ 6 mg/mL氟化鈉加10 mg/mL 碘乙酸鈉。

    ⅲ 果糖-6-磷酸鹽80 mg/mL水溶液。

    ⑤ 加試劑ⅳ 0.750mL, 室溫10 min。

    ⅳ 現用現配。鹽酸羥胺139 mg/mL。酸性極強，用氫氧化鈉中和至pH6.5。

    ⑥ 加試劑ⅴ和ⅵ各500 µL, 室溫5 min。

   ⅴ 三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。

   ⅵ 4 M HCl。

    ⑦ 加試劑ⅶ 500 µL, 顯色。紅褐色或紅紫色為陽(yáng)性，黃色為陰性。

    ⅶ 0.5 g/100 mL FeCl₃·6H₂O溶于0.1 M HCl。

    ⑵ 乙酸、乳酸等有機酸的測定——紙層析法

    ① 層析濾紙的制備——將層析濾紙剪成1.5cm*11cm的長(cháng)條狀，在距層析紙一端約4cm處用鉛筆劃線(xiàn)確定點(diǎn)陽(yáng)線(xiàn)，使用前充分干燥。

    ② 配制展開(kāi)劑——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

    ③ 配制標準液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

    ④ 制備待測樣品——將菌種37℃ 培養24h后離心，收集上清液

    ⑤ 點(diǎn)樣——用毛細管分別吸取發(fā)酵液，多次點(diǎn)樣于濾紙條上，樣點(diǎn)直徑不宜超過(guò)2mm，平衡2h

    ⑥ 層析——將點(diǎn)好樣的層析紙放入，使點(diǎn)有樣品的一端浸在展開(kāi)劑中，但不可浸及樣點(diǎn)。觀(guān)察展開(kāi)情況，待展開(kāi)劑前沿到達離層析紙另一端約1.5cm處，取出層析紙。

    ⑦ 顯色——以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發(fā)之后，向層析濾紙噴灑并計算Rf值。

注釋?zhuān)?/SPAN>物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用R_f值 (比移值 R_f value 又稱(chēng)R_f值) 來(lái)表示：

    R_f = 原點(diǎn)到層析中心的距離 / 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

    在一定的條件下某種物質(zhì)的R_f值是常數。R_f值的大小與物質(zhì)的結構、性質(zhì)、溶劑系統、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)，是一個(gè)定性分析的重要參數。

    ⑶糖發(fā)酵試驗

    糖發(fā)酵實(shí)驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來(lái)斷定。在配制培養基時(shí)預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）]，當發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。

本實(shí)采用現成的細菌生化微量鑒定管 ，鑒定管的種類(lèi)如下：

    乳糖    麥芽糖      甘露糖   甘露醇    蔗糖    阿拉伯糖 D-核糖   木糖（木膠糖）  半乳糖   松三糖  山梨糖    淀粉   水楊素    葡萄糖酸鹽       草糖（海藻糖）  血清菊糖   棉子糖    果糖   蜜二糖   纖維二糖

    具體實(shí)驗步驟：

    ① 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)�之后在無(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

    ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

    ③ 24h后觀(guān)察各管中液體變顏色情況，若變色則為陽(yáng)性，反之陰性，對照凌代文編著(zhù)的《乳酸細菌分類(lèi)鑒定及試驗方法》“鑒別雙歧桿菌屬內種的特征”表即可初步確定其種別。

五 注意事項

    1 注射器在使用前必須經(jīng)過(guò)121℃、20min滅菌。

    2 注意無(wú)菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。

    3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。

六 實(shí)驗結果記錄

（下列表格供參考）

表一  雙歧桿菌培養過(guò)程中菌落計數

表二  雙歧桿菌菌株屬的鑒定指標與鑒定結果

表三 雙歧桿菌菌株糖醇發(fā)酵試驗結果

     　          注：表中+表示待測菌株陽(yáng)性，-表示待測菌株陰性

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