微生物固體培養基凝固劑研究進(jìn)展

  微生物固體培養基凝固劑研究進(jìn)展

    在一般常態(tài)培養溫度下呈固體狀態(tài)的培養基都稱(chēng)固體培養基。固體培養基的凝固劑一般不是微生物的營(yíng)養成分,只起固化或粘合作用。常見(jiàn)凝固劑有瓊脂、明膠、無(wú)機硅膠等[1]。此外,由于微生物快速檢測的巨大需求而研制的微生物快速測試片,是通過(guò)凝固劑將營(yíng)養成份和特異顯色物質(zhì)粘附在塑料載體上而成,使用前不需進(jìn)行培養基制備和加熱而可直接應用。測試片中凝固劑有瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸系高分子化合物等[2]。

1　瓊脂

1.1　瓊脂的成分與分子結構　瓊脂(agar)產(chǎn)自石花菜或其他幾種紅海藻,包含有兩個(gè)組分:一個(gè)是可以形成結實(shí)而強力的凝膠,稱(chēng)“瓊脂糖”(agarose);另一個(gè)則是不會(huì )發(fā)生凝膠化的組分,稱(chēng)“瓊脂膠”(a garopectin)。瓊脂糖約占天然瓊脂80%,瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯。由于瓊脂的來(lái)源不同,瓊脂糖和瓊脂膠的含量也隨之變化[3]。瓊脂糖分子以線(xiàn)型鏈的形式存在,它是紅海藻的一個(gè)成分,與iota 和kappa 卡拉膠成鏡像關(guān)系。這一線(xiàn)型分子鏈包含有以(1→3)聯(lián)結的β-D 吡喃半乳糖基單元(A單元)與以(1→4)聯(lián)結的3,6 失水α-D 吡喃半乳糖基單元(B單元)相聯(lián)結。A單元及B單元構成二糖單元,因3,6 失水環(huán)接近于每個(gè)B單元,它可以很容易變化而發(fā)生水解。瓊脂糖的二糖單元及二級結構可表示如圖1[3,4]:

1.2.1　形態(tài)特征:成品瓊脂一般分為細長(cháng)條狀和粉末狀。細長(cháng)條狀的瓊脂在市場(chǎng)上常被稱(chēng)為“洋菜”,色類(lèi)白或淡黃色;半透明,表面皺縮,微有光澤,質(zhì)輕軟而韌,不易折斷;完全干燥后,則脆而易碎;無(wú)嗅無(wú)味[3]。

1. 2. 2　溶解性:高純度的瓊脂在常溫下實(shí)際上不溶于水,只吸收水分發(fā)生溶脹和微微地溶于乙醇胺和甲酰胺,在接近沸騰的情況下可分散到中水形成溶膠。其濃度達到15g/L的溶液時(shí)仍清澈透明[3]。

1. 2 .3　凝膠化溫度:瓊脂的凝膠化溫度遠低于凝膠融化溫度,其可用于微生物固體培養基的凝固劑也是因為這一點(diǎn)。由不同種類(lèi)的原料所制取的瓊脂,明顯地具有不同的凝固溫度,但來(lái)自相同原料的瓊脂,其凝固溫度基本上是一致的。用于微生物固體培養基凝固劑瓊脂的凝膠化溫度一般在35℃～40℃,而凝膠熔點(diǎn)應在75℃～85℃[3]。酸堿度對瓊脂的凝固性影響很大,而高溫高壓(1 1kg/cm2,1×105Pa)的影響很小。酸堿度是瓊脂在正常濃度范圍內能否凝固的關(guān)鍵因素。當4. 30<pH<10.05時(shí),瓊脂水溶液均可正常凝固,超過(guò)此范圍,培養基不能正常凝固[5]。

1.3　瓊脂的凝膠化原理　凝膠化是指體型縮聚反應進(jìn)行到一定程度,反應體系的黏度突然增加,并且出現具有彈性凝膠的現象。此時(shí),體系中包含了兩部分:一部分是凝膠,它具巨型網(wǎng)絡(luò )結構,不溶于一切溶劑;另一部分是溶膠,其分子量較小,被籠罩在凝膠的網(wǎng)絡(luò )結構中[6]。因此,凝膠是介于固體和液體之間的一種物質(zhì)狀態(tài)。根據交聯(lián)方式,凝膠可分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)兩種�；瘜W(xué)交聯(lián)是高分子鏈段間以共價(jià)鍵交聯(lián)起來(lái),這種交聯(lián)很牢固,使高分子只發(fā)生溶脹,而不能熔融更不溶解。物理交聯(lián)包括有氫鍵、庫倫力、配位鍵及物理纏結等形成的線(xiàn)性分子間的交聯(lián)[7]。瓊脂依靠高分子鏈段相互作用間可形成氫鍵而成為凝膠結構。這種氫鍵會(huì )因加熱等而被破壞,使凝膠變?yōu)槿苣z[8]。瓊脂的凝膠化主要是其瓊脂糖之間氫鍵結合的結果,其含有的大量的水在網(wǎng)絡(luò )結構穩定上發(fā)揮了重要的作用[9]。凝膠中水有幾種狀態(tài)存在,在高分子網(wǎng)絡(luò )附近的水與網(wǎng)絡(luò )有很強的相互作用。將緊挨著(zhù)高分子網(wǎng)絡(luò )的,在極低溫度下也不凍結的水稱(chēng)為不凍水;而將在 10℃ 20℃才凍結的水稱(chēng)為束縛水;離網(wǎng)絡(luò )很遠的水,顯示與普通水同樣的性質(zhì),稱(chēng)作自由水[7]。在溶膠狀態(tài),溫度接近水沸點(diǎn)時(shí),瓊脂分子是一種隨機卷曲狀態(tài)。溫度降至凝固點(diǎn),在凝膠狀態(tài)時(shí),瓊脂分子相互交聯(lián),形成三維網(wǎng)絡(luò )結構,基本結構為左手雙螺旋。沿著(zhù)螺旋軸兩側有很大的空穴,使瓊脂能結合足夠多的水[4]。瓊脂的流變性變化是瓊脂凝膠化過(guò)程中的一個(gè)重要特征。在溫度高時(shí),其流變行為與稀溶液中的聚合物流變行為相似;在溫度低至凝固點(diǎn)以下時(shí),流變行為像交聯(lián)的聚合物;溫度在溶膠和凝膠的變化過(guò)程中,流變性更為復雜。另外,瓊脂的流變性受瓊脂的濃度、分子量以及其它的物質(zhì)(如甘油)的影響[10～12]。

1. 4　瓊脂在微生物固體培養基凝固劑方面的應用　瓊脂是微生物固體培養基和半固體培養基中最常用的性能優(yōu)良的凝固劑。在液體培養基中加10～20g/L的瓊脂后加熱融化,凝固后即可得固體培養基,加5g/L的瓊脂可得半固體培養基[1]。陳宏偉經(jīng)過(guò)多次試驗后提出:用凝膠強度來(lái)計算瓊脂的用量更為科學(xué)。固體培養基的適宜凝膠強度為250～450g/cm2之間,這樣硬度的固體培養基,既有利于物質(zhì)的擴散和微生物對物質(zhì)的吸收,又有一定的硬度,有利于劃線(xiàn)、涂布和影印等技術(shù)的操作。而半固體培養基的適宜凝膠強度為90g/cm2左右,這樣的培養基既可以凝固而不流動(dòng),又不影響菌體的運動(dòng),用手輕輕敲打試管即可使培養基破碎[13]。

2　明膠明膠(gelatin)是膠原蛋白經(jīng)適度降解變性而得到的產(chǎn)物。作為一種蛋白質(zhì),明膠的氨基酸組成較為特殊,其含硫氨基酸很少,而甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸四種氨基酸含量很高,約占總氨基酸的67%。明膠大分子是由若干種氨基酸以肽鍵和次級鍵連接而成,肽鍵和次級鍵決定了大分子的結構,次級鍵有氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、酯鍵和二硫鍵等。明膠溶液的溫度在熔點(diǎn)以上時(shí)其分子呈無(wú)規則線(xiàn)團構象。當溫度降至凝固點(diǎn)以下時(shí),明膠分子的某些鏈段復旋為左手螺旋。相鄰3條左手螺旋鏈間產(chǎn)生氫鍵交聯(lián),復性為類(lèi)似膠原的右手超螺旋結構[14]。明膠成品為無(wú)色或淡黃色的透明薄片或微粒。明膠不溶于冷水,但可緩慢吸水膨脹軟化,明膠可吸收相當于其重量5～10倍的水。明膠可溶于熱水,形成熱可逆性凝膠[14]。明膠是最早用來(lái)作為凝固劑的物質(zhì),用量為液體培養基的5%～12%�？墒怯捎诿髂z的融化溫度(約25℃)和凝固溫度(約20℃)相差不大、比較容易被微生物分解、不適于較高溫度下長(cháng)期使用,以及耐加壓滅菌較差等缺點(diǎn),已逐漸被瓊脂所代替[1]。

3　無(wú)機硅膠硅膠(silicagel)是由多聚硅酸經(jīng)分子內脫水而形成的一種多孔性物質(zhì),其化學(xué)組Si02·XH20,屬于無(wú)定性結構。硅膠不溶于水和任何溶劑,無(wú)毒無(wú)味。由于硅膠為多孔性物質(zhì),具有較大的比表面,而且表面的羥基具有一定程度的極性,所以有很好的吸水性[15]。用于固體培養基的硅膠是由無(wú)機的硅酸鈉及硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時(shí)而形成的膠體,它不含有機物,主要用于分離與培養自養微生物的培養基[1]。

4　瓜爾膠瓜爾膠(guargum)是一種高純化多糖,就分子結構來(lái)說(shuō)是一種非離子化的半乳甘露聚糖,它以β (1→4)鍵連接的聚D 吡喃甘露糖為主鏈,D 吡喃半乳糖支鏈以α (1→6)鍵連接在主鏈上,其中甘露糖與半乳糖的摩爾比約為2∶1[16]。瓜爾膠極易溶于冷水和熱水、無(wú)毒、在一般情況下不形成凝膠,不過(guò)在高壓滅菌鍋滅菌冷卻后可以形成凝膠。并且形成的凝膠在70℃以下是不可溶的[17]。瓜爾膠在固體培養基的用量為30～40g/L,根據其高溫不溶的特性,可用于嗜熱菌的分離和保藏。細菌和真菌在其上面有良好的生長(cháng),真菌還要比在瓊脂上長(cháng)得更好一些,而且瓜爾膠要比瓊脂便宜8倍,所以其有巨大的應用價(jià)值[17]。

5　卡拉膠卡拉膠(carrageenan)是從海藻中提取來(lái)的一種陰離子多糖,其結構根據原料來(lái)源不同而不同,可溶于熱水,不溶于乙醇、異丙醇等,基本骨架是α 1,3和β 1,4糖苷鍵交替聯(lián)結形成的半乳聚糖重復單元�？ɡ�膠的粘度很大,在濃度低至2g/L時(shí)也能形成凝膠,不過(guò)形成凝膠時(shí)是離子(K+或Ca+)依賴(lài)性的�？ɡ�膠約60℃熔化,45℃凝固[18]。由于卡拉膠是一種離子依賴(lài)型凝膠劑,所以無(wú)法完全代替瓊脂。但可用于某些微生物的培養,其用量約為10g/L[19]。

6　黃原膠黃原膠(xanthangum)是由D 葡萄糖、D 甘露糖、D 葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸組成的“五糖重復單元”結構聚合體。主鏈和側鏈間通過(guò)氫鍵形成雙螺旋和多重螺旋結構[20]。黃原膠既能溶于熱水,又能溶于冷水;不能發(fā)生凝膠化;具有很強的粘性,具有高度的生物穩定性,多數酶類(lèi)不能對其降解[20]。

7　刺槐豆膠刺槐豆膠(locustbeangum)是一種無(wú)色,無(wú)味的植物胚乳精制多糖。刺槐豆膠是以甘露糖為主鏈的半乳甘露聚糖,甘露糖與半乳糖的比例為1∶4,分子量大約為300kD。刺槐豆膠本身無(wú)凝膠特性,其最重要的特點(diǎn)是與瓊脂、卡拉膠及黃原膠等親水膠體有良好的凝膠協(xié)同效應,可使復合后的用量水平很低并改善凝膠組織結構。普通刺槐豆膠在冷水中只有部分溶解,加熱至85℃保持10min以上才能充分水化[21]。

8　聚丙烯酸系高分子化合物聚丙烯酸系(PAA)高分子化合物是一種化學(xué)合成的高吸水性樹(shù)脂。高吸水性樹(shù)脂可以吸收自身質(zhì)量的幾百乃至上千倍的水,不但具有優(yōu)良的吸水性能,而且具有卓越的保水能力;即使加壓,所吸收的水也不溢出。自然界中能吸水的物質(zhì)很多,按其吸水的性質(zhì)來(lái)分,基本上分為兩類(lèi):一類(lèi)是物理吸附,其吸水主要是毛細管的吸附原理,所以這類(lèi)物質(zhì)吸水能力不高,只能吸收自重的幾十倍的水,一旦施壓,水就逸出。另一類(lèi)是化學(xué)吸附,是通過(guò)化學(xué)鍵的方式把水和親水性物質(zhì)結合在一起成為一個(gè)整體。此種吸附結合很牢,加壓也不會(huì )失水。高吸水性樹(shù)脂是由三維空間網(wǎng)絡(luò )構成的高聚物,它帶有大量親水基團(如羧基、羥基、羧酸鹽、酰胺基等)。它的吸水,既有物理吸附,又有化學(xué)吸附。因此,它具有神奇的吸水能力以及較高的保水能力[22]。

9　討論

雖然瓊脂已經(jīng)被應用了100多年,它的可應用性也得到了大家的充分認可,可是由于其資源的過(guò)分開(kāi)采而導致價(jià)格上升,尋找一種較便宜的膠體來(lái)代替很有必要。另外,有些情況下瓊脂并不適用,如高溫培養。這樣,需要人們去尋一種新的膠體來(lái)代替或兼而用之。過(guò)去一段時(shí)間里,雖然人們做了大量的嘗試,取得了一定的成果,但仍未找到一種可以完全代替之的物質(zhì)。所以,我們還要繼續努力,從瓊脂的可應用原理出發(fā),來(lái)選擇新的膠體或來(lái)對現有的膠體改性,以達到應用目的�？焖贉y試片由于其簡(jiǎn)便、準確、省時(shí)、省力、可應用于現場(chǎng)等特點(diǎn),將會(huì )在檢測部門(mén)廣泛推廣�？墒乾F有產(chǎn)品的凝固劑吸水性不好,不能快而均勻地吸收水分,使菌體生長(cháng)不均勻而導致檢測結果的偏差。所以尋找一種可用于檢測片的膠體也十分重要。隨著(zhù)高分子化學(xué)的發(fā)展,天然高分子聚合物的凝膠化和流變性原理已越來(lái)越透徹,吸水、保水原理也已明確。對其改性得到所需的產(chǎn)品是可能的。聚丙烯酸系高分子化合物的合成機理和方法已經(jīng)十分成熟,合成可用于測試片的高分子物質(zhì)也是可行的。

參考文獻（略）

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