一株高效褐藻膠降解菌的篩選及其性質(zhì)的初步研究

一株高效褐藻膠降解菌的篩選及其性質(zhì)的初步研究

王麗娟 展長(cháng)淑 孫彥粉 王振杰

（山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院，山東威海 264209）

摘要：從威海近海天然腐爛的海帶中分離得到10株褐藻膠降解菌。以海藻酸鈉為唯一碳源，通過(guò)馴化培養、初篩、復篩得到一株優(yōu)勢菌。本課題對該優(yōu)勢菌的最適生長(cháng)條件及最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，并對其酶的性質(zhì)做了初步研究。

關(guān)鍵詞：褐藻膠降解菌；篩選；最適生長(cháng)條件：最適產(chǎn)酶條件：降解酶性質(zhì) 

    褐藻膠(algin)是褐藻細胞壁的填充物質(zhì)，是一種由α-D-甘露糖醛酸和β-L-古羅糖醛酸兩種單糖組成的線(xiàn)形多糖^[1]。褐藻膠應用廣泛，但其相對分子質(zhì)量較大，導致其溶解度較低，溶液粘性較大，應用受到很大限制。近年來(lái)，褐藻膠寡糖生物活性的研究取得了重大進(jìn)展，如調節植物生長(cháng)、誘導植物抗病能力、抗腫瘤及抗老年癡呆，以及防治海洋無(wú)脊椎動(dòng)物常見(jiàn)病的功能等^[2]。因而通過(guò)各種降解方法制備的褐藻膠寡糖在糖化學(xué)、糖生物學(xué)、糖工程及糖類(lèi)藥物研究領(lǐng)域具重要的研究?jì)r(jià)值。目前褐藻膠寡糖的獲取方法主要有物理降解法、酸降解法，氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一種條件溫和、可控性強和特異性高的生物降解方法，是目前的主要研究方向^[3]。因此褐藻膠降解酶具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值和研究意義。本項目的研究重點(diǎn)在于利用微生物得到降解酶并最終獲得寡糖，通過(guò)誘導篩選出產(chǎn)酶量高、酶活性強的優(yōu)勢菌株，確定出其最適生長(cháng)條件和最適產(chǎn)酶條件，并對降解酶的性質(zhì)做出初步研究。

1．材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣品采集

腐爛海帶采集于山東省威海市近海

1．1．2培養基成分

初篩培養基（g/L）：海藻酸鈉10；硝酸鉀1.0；氯化鈉15；磷酸氫二鉀0.5；硫酸鎂0.5；硫酸亞鐵 0.01；瓊脂15-20；水1000mL

馴化培養基（g/L）：褐藻酸鈉；氯化鈉15；蛋白胨1.0；磷酸氫二鉀1.0；磷酸二氫鉀1.0；磷酸氫二鈉1.0；硫酸鎂0.5；硫酸亞鐵0.01；水1000mL

復篩及發(fā)酵培養基（g/L）：褐藻酸鈉10;硫酸銨 5.0;磷酸氫鉀2.0;氯化鈉l5；硫酸鎂1.0；硫酸亞鐵0.01；酵母膏 1.0;水1000mL

保藏培養基（g/L）：牛肉膏5.0 ；蛋白胨10 ；磷酸氫二鈉 2；氯化鈉5;瓊脂5-7;水1000ml；PH7.4-7.6

1．2 實(shí)驗方法

1．2．1 菌株的馴化

用海水浸泡天然腐爛海帶，制備菌懸液，取1ml菌懸液移入到30ml含海藻酸鈉2g/L的馴化培養基中，同時(shí)觀(guān)察培養液的變化，3天后，取1ml馴化液至新鮮馴化培養基中，海藻酸鈉濃度按4、6、8、10g/L逐步提高，共馴化5代。

1．2．2 菌種的分離

取第5代培養液適當稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上。30℃培養72小時(shí)。待菌落長(cháng)好，挑取不同形態(tài)特征的菌落，劃線(xiàn)分離直至得到純化的單菌落。

1．2．3 菌種的初篩

將分離得到的單菌落接于初篩平板上，置30℃培養72小時(shí)后，選取在平板上生長(cháng)的菌株，接種到斜面4℃冰箱保藏備用。

1．2．4 菌種的復篩

1．2．4．1制備液體菌株

將30ml發(fā)酵培養基裝入100ml三角燒瓶中，于121.5℃滅菌。挑取一環(huán)新鮮的初篩菌株斜面種子，于28℃搖瓶培養48小時(shí)。

1．2．4．2

在100ml三角燒瓶中裝入發(fā)酵培養基50ml按2%（體積分數）的接種量接入液體菌種，28℃搖瓶培養72小時(shí)后測定發(fā)酵培養基中生物量,并用3，5-二硝基水楊酸法酶活。對菌體用細胞破碎儀進(jìn)行破壁后再測酶活。

1．2．4．3寡糖含量與生物量的測定

生物量的測定：用721型分光光度計為620nm處測定發(fā)酵液的吸光度值，以空白發(fā)酵培養基作對照。

寡糖含量的測定：本實(shí)驗采用兩種方法測定寡糖含量。第一，可用3，5-二硝基水楊酸法測定酶解產(chǎn)物中還原糖的含量。反應體系溶液包括，1.0ml 1%海藻酸鈉溶液，4ml 0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液和1ml發(fā)酵液，于40℃恒溫水浴30分鐘，取出后立即于沸水浴中煮沸15分鐘，使酶失活，得糖化液，取糖化液.0ml加入3，5-二硝基水楊酸顯色劑2.5ml，在沸水中水浴15分鐘，冷卻后稀釋至25ml搖勻，以1.0ml煮沸失活的發(fā)酵液代替發(fā)酵液或空白，于550nm處比色^[4]。

第二，將發(fā)酵液用高速離心機于8000r/min離心20分鐘，取上清液，用752型分光光度計于235nm處直接測定吸光度值以確定寡糖含量。

1．2．4．4優(yōu)勢菌種測定

確定對褐藻酸鈉有較好降解能力的菌株作為降解優(yōu)勢菌。

1．2．5優(yōu)勢菌最適生長(cháng)條件確定

以海藻酸鈉為唯一碳源，分別將優(yōu)勢菌置于不同的海藻酸鈉濃度，溫度，鹽度，培養時(shí)間等條件下培養，測其生物量和寡糖含量。每組實(shí)驗重復3次，取其平均值，并確定菌種最適生長(cháng)條件。

1．2．6降解酶性質(zhì)的初步研究

用800mL培養基，2%接種量發(fā)酵增殖優(yōu)勢菌種，48h后，將發(fā)酵液4℃下 8000r/min離心20分鐘，棄去沉淀，上清液75%硫酸銨鹽析過(guò)夜。鹽析后，5000r/min離心后棄去上清液，將沉淀重溶于300mL蒸餾水，即為粗酶液。每一試管中加入2mL粗酶液和10mL1測定粗酶液的溫度、PH、底物濃度等最適反應條件。

2.結果與討論

2．1海藻酸鈉高效降解菌株的篩選

將從近海取得的腐爛海帶制備菌懸液，進(jìn)行馴化后，利用稀釋涂布平板法進(jìn)行分離及以海藻酸鈉為唯一碳源的初篩培養基平板進(jìn)行篩選，初篩出10株可利用海藻酸鈉的菌株，其菌落形態(tài)見(jiàn)表1。

表1  10株分離菌株的菌落形態(tài)

再通過(guò)測定生物量和寡糖含量來(lái)檢測該株菌降解海藻酸鈉的能力。結果經(jīng)平板分離后得到10株菌可在以海藻酸鈉為唯一碳源的培養基上生長(cháng)，而10號菌株的酶活力明顯比其他菌株強，亦即該菌對海藻酸鈉有較強的降解能力。因此，本研究選定10號菌株作為海藻酸鈉高效降解菌。 

2．2 優(yōu)勢菌最適生長(cháng)條件的確定

2．2．1 培養時(shí)間

  通過(guò)發(fā)酵培養測定培養天數對該菌生長(cháng)的影響。

2．2．2  海藻酸鈉濃度

    以不同濃度的海藻酸鈉配制培養基，測定不同濃度的海藻酸鈉濃度對該菌生長(cháng)情況和分解產(chǎn)生寡糖的影響。

菌液離心后235nm處測吸光度，以測定培養集中的寡糖含量。

褐藻酸鈉濃度為10g/L時(shí)菌種產(chǎn)酶量最大，隨后，隨著(zhù)褐藻酸鈉濃度的增大，產(chǎn)酶量逐漸降低。即該菌種的最適產(chǎn)酶褐藻酸鈉濃度為10g/L。

2.2．3 NaCl濃度

測定不同NaCl濃度對該菌生長(cháng)情況和分解產(chǎn)生寡糖的影響。

稀釋十倍后于620nm測菌液吸光度。由結果可知，NaCl濃度為20g/L時(shí)生物量達最大，該菌生長(cháng)最好。NaCl濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于該菌生長(cháng)。在即該菌種的最適生長(cháng)鹽度為20g/L。

離心后235nm測吸光度。NaCl濃度為15g/L時(shí)吸光度值達最大，即產(chǎn)酶量最大。最適產(chǎn)酶鹽度為15g/L。

2．2．4培養溫度

    將該菌至于不同的溫度下進(jìn)行培養，測定溫度對該菌株生長(cháng)的影響。將分離得到的優(yōu)勢菌種分別于20℃，25℃，30℃，37℃條件下培養，2天后分別于620nm處測菌液生物量，菌液離心后于235nm處測寡糖含量。將菌液稀釋十倍后的生物量測定結果，菌液離心后于235nm處測寡糖含量結果。由上述兩圖可知該菌的最適生長(cháng)溫度為28℃左右，最適產(chǎn)酶溫度為30℃。溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于菌的生長(cháng)和產(chǎn)酶。

2.3降解酶性質(zhì)的研究

發(fā)酵增殖優(yōu)勢菌種并提取粗酶液，通過(guò)在不同的溫度、PH及底物濃度下的反應，稀釋十倍后，測定其235nm處吸光度值確定最適產(chǎn)寡糖條件，進(jìn)而確定最適酶反應條件。

2.3.1底物濃度對酶活的影響

每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度分別為0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%，2.2%的海藻酸鈉水溶液，反應20分鐘后，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。

酶的最使反應底物濃度為1.8g/L。之后隨著(zhù)底物濃度的增加酶活性基本不再增加。

2.3.2 pH對酶活的影響

每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度分別為1%的海藻酸鈉水溶液，至于不同的pH條件下，反應20分鐘后，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。

酶的最使反應pH為7.2。pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì )對酶活性產(chǎn)生影響,使酶活降低。

2.3.3溫度對酶活的影響

每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度為1%海藻酸鈉水溶液，置于不同溫度條件下，反應20分鐘后，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。

酶的最使適應溫度為35℃。在一定范圍內，隨著(zhù)溫度的升高酶活性逐漸增高，至35℃時(shí)隨著(zhù)溫度的升高酶活性開(kāi)始降低。

討論

   本實(shí)驗篩選出10株降解褐藻膠的菌株并通過(guò)比較確定了酶活性最高的優(yōu)勢菌株。并確定了其最適生長(cháng)條件和最適產(chǎn)酶條件并對其酶的性質(zhì)作出初步研究。該實(shí)驗表明低溫條件下該菌生長(cháng)和產(chǎn)酶能力都比較低，說(shuō)明該菌自然條件下對海帶的致病力不是很強，但該菌具有良好的體外降解褐藻膠的能力。

    該菌的分類(lèi)及其生理生化性質(zhì)尚不明確，所產(chǎn)酶的結構性質(zhì)和結構機理也不十分清楚，有待近一步研究。

參考文獻：

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