行業(yè)標準——磷細菌肥料

  中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準

磷細菌肥料

Phosphate bacteria fertilizer　               

前 言

本標準在原有標準NY227-1994《微生物肥料》的基礎上，對其中的磷細菌肥料部分進(jìn)行修改。

主要修改內容如下：

—增加術(shù)語(yǔ)、抽樣和判定規則部分；

—增加菌種部分，包括菌種有效性、菌體特性特征、菌落形態(tài)；

—刪除成品無(wú)害化指標。因為磷細菌肥料一般以草炭為載體，不存在重金屬的危害。草炭經(jīng)高溫滅菌后，大腸桿菌和蛔蟲(chóng)卵不再存在。

本標準自實(shí)施之日起，同時(shí)代替NY227-1994中的磷細菌肥料部分。

本標準的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D都是標準的附錄。

本標準由中華人民共和國農業(yè)部提出。

本標準起草單位：農業(yè)部微生物肥料質(zhì)量監督檢驗測試中心、中國農業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所。

本標準主要起草人：梁紹芬、姜瑞波、葛誠、李俊、沈德龍。

磷細菌肥料

Phosphate bacteria fertilizer

1 范圍

本標準規定了磷細菌肥料產(chǎn)品的分類(lèi)、技術(shù)要求、檢驗方法、檢驗規則、包裝、標識、運輸和貯存等。

本標準適用于含有益磷細菌微生物，能分解土壤中的難溶性磷化物，改善作物磷素營(yíng)養狀況，又能分泌刺激素剌激作物生長(cháng)發(fā)育的活體微生物制品。

2 引用標準

下列標準所包含的條文，通過(guò)在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時(shí)，所示版本均有效。所有標準都會(huì )被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

GB/T 6543-1986 瓦愣紙箱

NY 411-2000 固氮菌肥料

3 定義

本標準采用下列定義：

3.1磷細菌肥料

能把土壤中難溶性的磷轉化為作物能利用的有效磷素營(yíng)養，又能分泌激素刺激作物生長(cháng)的活體微生物制品。

4  產(chǎn)品分類(lèi)

4.1 按劑型不同分為：液體磷細菌肥料、固體粉狀磷細菌肥料和顆粒狀磷細菌肥料。

4.2 按菌種及肥料的作用特性分為：有機磷細菌肥料、無(wú)機磷細菌肥料。

4.2.1 有機磷細菌肥料：能在土壤中分解有機態(tài)磷化物(卵磷脂、核酸和植素等)的有益微生物經(jīng)發(fā)酵制成的微生物肥料。分解有機態(tài)磷化物的細菌有芽胞桿菌屬中的種(Bacillus sp.)、類(lèi)芽胞桿菌屬中的種(Paenibacillus sp.)。

4.2.2 無(wú)機磷細菌肥料：能把土壤中難溶性的不能被作物直接吸收利用的無(wú)機態(tài)磷化物溶解轉化為作物可以吸收利用的有效態(tài)磷化物。分解無(wú)機態(tài)磷化物的細菌有假單胞菌屬中的種(Pseudomonas sp.)、產(chǎn)堿菌屬中的種(Alcaligenes sp.)、硫桿菌屬中的種(Thiobacillus sp.)。

使用本標準規定之外的菌種生產(chǎn)磷細菌肥料時(shí),菌種必須經(jīng)過(guò)鑒定,而且必須為非致病菌菌株。

5 技術(shù)要求

5.1 菌種的有效性

用于生產(chǎn)磷細菌肥料的菌種,必須是從國家菌種中心或國家科研單位引進(jìn)的并經(jīng)過(guò)鑒定對動(dòng)物和植物均無(wú)致病作用的非致病菌菌株；這些菌株在含有卵磷脂或磷酸三鈣的瓊脂平板上培養,能觀(guān)察到明顯的溶磷圈；發(fā)酵培養后解磷量與不接菌對照比較有顯著(zhù)差異（p≤0.05）。

5.1.1 有機磷細菌：芽胞桿菌屬的細菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，能產(chǎn)生抗熱的芽胞，為橢圓形或柱形周生或側生鞭毛，能運動(dòng)，能產(chǎn)生接觸酶。

5.1.2 無(wú)機磷細菌：假單胞菌屬中的細菌為革蘭氏染色陰性桿菌，極生的單鞭毛或叢鞭毛，能運動(dòng)，接觸酶陽(yáng)性。此屬中的部分菌株為致病菌，必須進(jìn)行嚴格的菌種鑒定后才能用于生產(chǎn)。產(chǎn)堿菌屬的細菌，細胞呈桿狀，1-4根周生鞭毛，能運動(dòng)，革蘭氏染色呈陰性，接觸酶陽(yáng)性。硫桿菌屬的菌為革蘭氏染色陰性小桿菌，單根極生鞭毛，能運動(dòng)，嚴格自養。

5.2 產(chǎn)品技術(shù)指標

5.2.1 液體磷細菌肥料技術(shù)指標。

5.2.2 固體（粉狀）磷細菌肥料技術(shù)指標見(jiàn)表2。

表2 固體（粉狀）磷細菌肥料技術(shù)指標

　 5.2.3 固體（顆粒）磷細菌肥料技術(shù)指標見(jiàn)表3。

表3 固體（顆粒）磷細菌肥料技術(shù)指標

6 抽樣

按每一發(fā)酵罐菌液制成的產(chǎn)品為一批，逐批抽樣檢驗。抽樣過(guò)程要嚴格避免雜菌污染。6.1 抽樣工具及用品

抽樣前預先準備好無(wú)菌塑料袋(或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標簽、抽樣封條和膠水。

6.2 抽樣數量及抽樣方法

在成品庫抽樣，按圖形分層設點(diǎn)抽樣，抽樣以件為單位，小包裝產(chǎn)品以一包裝箱為一件。大包裝（30-50kg）產(chǎn)品以一袋（或一桶）為一件。抽樣基數由樣品基數的大小確定。1-10件，全部抽樣。11-200件，抽樣10件；201-400件，抽取20件。樣品基數大于400件，按照超過(guò)部分的2%增加抽樣件數�？偧�數不超過(guò)40件。

每件小包裝產(chǎn)品抽取一小袋，在無(wú)菌條件下每袋取樣200g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。最后貼上抽樣標簽和抽樣封條（液體肥料小包裝亦參照此法進(jìn)行）。所抽樣品一份留存被抽樣單位，一份交檢測中心檢測。

7 檢驗方法

7.1 儀器設備及試劑

7.1.1 儀器設備

生物顯微鏡（10×100）；

菌落計數器；

恒溫培養箱；

恒溫干燥箱；

恒溫搖床；

滅菌鍋；

無(wú)菌室或超凈工作臺；

酸度計；

試管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培養皿：直徑9cm；

三角瓶：500mL；

無(wú)菌吸管：1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

濾紙；

酒精燈；

標準篩：孔徑0.18mm，2.5 mm，5.0mm；

1號羊毛畫(huà)筆；

鋁盒。

7.1.2 試劑和培養基

7.1.2.1 試劑

蒸餾水；

無(wú)離子水；

無(wú)菌水。

7.1.2.2 培養基（見(jiàn)附錄D）

7.2 成品檢驗

7.2.1 氣味檢驗

將液體活固體磷細菌肥料的包裝打開(kāi)，用手煽動(dòng)包裝口處的空氣，嗅其氣味。

7.2.2 外觀(guān)檢驗

將固體磷細菌肥料包裝打開(kāi)，置于白色搪瓷盤(pán)中，液體肥料搖勻，在明亮的光線(xiàn)下進(jìn)行觀(guān)察。

7.2.3 pH值測定

液體磷細菌肥pH值測定：取供檢菌液于50mL燒杯中直接用酸度劑測定pH值，取三次測定結果的平均值。

固體磷細菌肥pH值測定：稱(chēng)取供檢樣品15.0g，置于50mL燒杯中，用量筒取30.0mL蒸餾水，用磁力攪拌使溶液均勻后，用酸度計測定pH值。取三次測定結果的平均數。

7.2.4 含水量測定

稱(chēng)取固體磷細菌肥料三份，每份20.00g，精確到0.01g，放入已稱(chēng)恒重的鋁盒中。置105℃干燥箱內烘烤4h，移至干燥器內，冷卻后稱(chēng)重。根據烘干前后質(zhì)量差按式(l)計算含水量。取三個(gè)樣品測定數的平均值。平行樣品絕對偏差應低于1%。

含水量(%)=（m₀-m₁）/m₀×100 ………………(1)

式中：m₀一烘干前樣品質(zhì)量，g

      m₁一烘干后樣品質(zhì)量，g。

7.2.5 吸附劑顆粒細度測定

稱(chēng)樣10.00g(精確至0.01g)，置于標準篩中(直徑分別為0.18mm和0.15mm)，用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過(guò)為止。將篩余物置105-110℃溫度下烘干，稱(chēng)重。篩余物百分含量按式(2)計算：

篩余物(%)=篩余物質(zhì)量/（1-樣品含水量百分數）/樣品質(zhì)量×100 ………(2)

顆粒肥料的粒徑稱(chēng)樣后直接通過(guò)2.5mm和4.5mm的標準篩即可。

7.2.6 磷細菌有效活菌數及雜菌率的測定

采用平板計數法測定磷細菌活菌數及雜菌率。

7.2.6.1 制作肉湯培養基平板和馬丁培養基平板（配方見(jiàn)附錄D）

7.2.6.2 樣品稀釋培養及計數

  稱(chēng)取10.00g供檢樣品，加入帶玻璃珠的100mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0mL加入90mL的無(wú)菌水中)，在旋轉式搖床上200r/min充分振蕩30min，靜置20min后，即成母液的菌懸液。

  用無(wú)菌吸管分別吸取5mL上述母液的菌懸液加入45mL無(wú)菌水中，混勻成1：10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋?zhuān)�分別得到1：1×10²，1：1×10³，1：1×10⁴，1：1×10⁵等濃度（每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管）。

  用0.5mL無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至直徑為9cm的含培養基的平板上，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，每個(gè)樣品取3個(gè)連續適宜稀釋度，每一稀釋度重復3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對照。28℃-30℃培養2-5d。在馬丁培養基上加入10^-3稀釋度菌懸液測定霉菌數。

7.2.6.3 菌落識別及計數

  根據被檢產(chǎn)品菌種的菌落特征于雜菌區別開(kāi)。必要時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色（見(jiàn)附錄A）或芽胞染色（見(jiàn)附錄B），在顯微鏡下觀(guān)察，取菌落20-300的平板計數。計算出三個(gè)重復的有效磷細菌菌落平均數。

  有效磷細菌菌落以外的其他細菌菌落為細菌雜菌菌落數。在馬丁培養基上計出霉菌數。有效磷細菌活菌數按式（3）計算：

有效活菌數（個(gè)/g）=菌落平均數×稀釋倍數×母液菌懸液的體積/菌劑克數或毫升數/加樣量 …………………(3)

雜菌率(%)=雜菌總數/（磷細菌數+雜菌總數）×100 …………………(4)

7.2.6.4 磷細菌解磷效能測定

a、平皿定性測定

將有機磷細菌或無(wú)機磷細菌培養基融化后冷卻至45℃左右倒入滅菌平皿，每皿約15mL左右，凝固后培養基表面無(wú)冷凝水后待用。待測菌種活化后加入適量無(wú)菌水，刮下菌苔，制成均勻的菌懸液。用滅菌滴管滴入備用的平板上，每皿可均勻地分別滴四個(gè)點(diǎn)。待滴入的菌懸液干后才可反轉置于28-30℃恒溫箱中培養2-3d后觀(guān)察結果。在菌落周?chē)�有透明圈為有溶磷活或解磷作用，無(wú)透明圈的為不溶磷、少溶磷，或不解磷、少解磷。

b、鉬銻抗比色法定量測定

將磷細菌接種到相應的磷細菌液體培養的三角瓶中，置搖床（200r/min）上保溫30℃振蕩培養72h。下?lián)u床后加入無(wú)磷活性炭脫色高速離心，將上清液傾出待測。用鉬銻抗比色法測定有效磷含量（見(jiàn)附錄C）。

7.2.7 有效期的檢驗

在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)標明的有效期到達前10d測定活菌數，活菌數達到標準要求的即為有效期合格。

8 檢驗規則（判定規則）

8.1 檢驗分類(lèi)

8.1.1 產(chǎn)品出廠(chǎng)檢驗

產(chǎn)品交貨時(shí)進(jìn)行的檢驗。

8.1.2 產(chǎn)品型式檢驗

新產(chǎn)品鑒定或國家質(zhì)檢機構質(zhì)量監督檢驗。

8.2 檢驗項目

型式檢驗的檢驗項目按5.2.1或5.2.2要求進(jìn)行。出廠(chǎng)檢驗不檢有效期。

8.3 判定規則

菌肥中有效活菌數的數量是微生物肥料質(zhì)量關(guān)鍵指標，是一切微生物肥料的產(chǎn)品必須達到的指標。所規定的外觀(guān)、水分、細度、有機質(zhì)、pH值作為微生物肥料質(zhì)量檢驗參考指標。

對產(chǎn)品是否合格作如下規定：

a)   產(chǎn)品有效活菌數不合格時(shí)該產(chǎn)品判定為不合格產(chǎn)品；

b)  有效活菌數合格，雜菌率合格，參考指標四項（包含四項）以上不合格，該產(chǎn)品判定為不合格品；

c)  產(chǎn)品有效活菌數符合指標，雜菌率不符合指標，但小于本標準規定的兩倍時(shí)參考指標一項不合格者，該產(chǎn)品判定為合格產(chǎn)品；參考指標有兩項（含兩項）以上不合格者，該產(chǎn)品判定為不合格產(chǎn)品；

   產(chǎn)品有效活菌數符合指標，雜菌率大于本標準規定的兩倍；或微生物肥料霉菌數≥6.0×10^-5個(gè)/g(mL)，拌種劑霉菌數≥3.0×10^-5個(gè)/g(mL),判為不合格產(chǎn)品。

9 包裝、標識、運輸和貯存

9.1 包裝

9.1.1 內包裝

液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。顆粒肥料亦可用編制袋包裝。

9.1.2 外包裝

外包裝采用紙箱，紙箱質(zhì)量應符合GB/T 6543要求。箱外用尼龍打包帶加固。

9.1.3 每箱(袋)產(chǎn)品中附有產(chǎn)品合格證和使用說(shuō)明書(shū)，在使用說(shuō)明中標明使用方法、用量及注意事項。

9.2 標識、運輸和貯存

磷細菌肥料的標識、運輸和貯存按NY 411-2000中的9.2、9.3和9.4執行。

上一篇：魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗制作規程(2)

下一篇：公共場(chǎng)所毛巾、床上臥具微生物檢驗方法