魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗制作規程(1)

魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗制作規程 

前   言

 　　為規范魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗制作要求，保證疫苗質(zhì)量，特制定本標準。

本標準的附錄A、附錄B為規范性附錄。

1　范圍

　　本標準規定了魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“疫苗”)制作的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)要求、生產(chǎn)工藝流程、菌種生產(chǎn)、操作規程、發(fā)酵生產(chǎn)操作規程、安全性檢測、效力檢驗、產(chǎn)品分裝與保存、留樣待檢。

　　本標準適用于我省魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的生產(chǎn)。

2　規范性引用文件

　　下列文件中的條款通過(guò)本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

　　GB 6388 運輸包裝收發(fā)貨標志

3　術(shù)語(yǔ)與定義

　　下列術(shù)語(yǔ)與定義適用于本標準。

　　嗜水氣單胞菌滅活疫苗

　　嗜水氣單胞菌培養液加入適量的福爾馬林溶液，在一定的恒溫條件下經(jīng)適當時(shí)間滅活后制成的全菌液。

4　技術(shù)要求

　　按附錄A的要求執行。

5　生產(chǎn)工藝流程

   原菌種活化 → 菌種擴大培養 →  種子罐培養  →   發(fā)酵罐培養  →  滅活 →　安全性檢測 →  效力檢測 →  產(chǎn)品分裝。

6　菌種生產(chǎn)操作規程

6.1　儀器設備和試劑

　　無(wú)菌室或超凈工作臺、滅菌鍋、三角瓶、試管、冰箱、恒溫培養箱、顯微鏡、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨和瓊脂等。

6.2　培養基制備

　　按如下配方制備培養基：取牛肉膏0.6%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%，將瓊脂加熱溶化后用0.1mol/L氫氧化鈉或鹽酸調節pH值為7.0～7.5，然后分裝三角瓶或試管，置于滅菌鍋內，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面備用。

6.3　菌種活化與擴大培養

6.3.1　菌種來(lái)源

　　菌種來(lái)源為經(jīng)系統鑒定的致病性嗜水氣單胞菌。

6.3.2　活化與擴大培養

　　在無(wú)菌條件下從嗜水氣單胞菌原菌種斜面上挑取少量菌苔，置放試管斜面內進(jìn)行劃線(xiàn)，然后置28℃溫箱內培養（22～28）h，經(jīng)檢查無(wú)雜菌，菌體生長(cháng)整齊后，從試管斜面挑取菌苔再次重新接種，在28℃溫箱內培養（22～28）h，用肉眼觀(guān)察，如菌苔豐滿(mǎn)，無(wú)雜菌，則放4℃冰箱中備用。否則重作。

7　發(fā)酵生產(chǎn)操作規程

7.1　儀器設備和藥品

　　種子罐、發(fā)酵罐、顯微鏡、麥氏比濁管、試管、載玻片、三角瓶、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、生理鹽水等。

7.2　種子罐培養

7.2.1　培養基

　　按如下配方制備培養基：取牛肉膏0.6%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%�；烊芎笳{pH值為7.0～7.5。

7.2.2　空罐滅菌

　　將空發(fā)酵罐清洗干凈，在0.11MPa壓力下滅菌30min。

7.2.3　裝料

　　將7.2.1條配方的培養基灌裝，投料量不得超過(guò)罐容積的70%。

7.2.4　滅菌

   裝好料后，在0.11MPa壓力下滅菌30min。

7.2.5　接種

　　發(fā)酵罐滅菌后冷卻致28℃即可接種。在無(wú)菌條件下將每個(gè)三角瓶斜面菌種加（100～500）ml無(wú)菌水，把菌苔刮下制成菌懸浮液，含菌量為10CFU/ml。將制好的菌懸浮液，在無(wú)菌條件下，按1%的比例接種于冷卻至28℃的種子罐內進(jìn)行培養。

7.2.6　培養條件的控制

　　接種后在溫度為28℃，壓力為0.05MPa，通氣量1∶1（每分鐘進(jìn)出空氣體積比）和220r/min攪拌條件下，培養（22～28）h。

7.2.7　培養過(guò)程中的檢測

7.2.7.1　指標

　　接種后22h開(kāi)始，每隔2h取樣一次檢測，包括菌體生長(cháng)狀況、含菌量和pH值，達到如下指標，即可移種至發(fā)酵罐內發(fā)酵培養。

　　a）菌體生長(cháng)整齊；

　　b）處于對數生長(cháng)期；

　　c）含菌量10×10⁸ CFU /ml以上；

　　d）無(wú)雜菌污染；

　　e）pH值為7.0～7.5。

7.2.7.2　檢測方法

　　a）在無(wú)菌條件下，取培養液（50～100）ml，于滅菌三角瓶中，備用；

b）用無(wú)菌吸管或接種環(huán)取發(fā)酵液一滴，置于潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀(guān)察菌體生長(cháng)狀況，判定是否有雜菌生長(cháng)；

　　c）含菌量檢測　細菌計數采用傾注平板法或用麥氏比濁管估測，麥氏比濁管細菌計數按附錄B的方法執行。

7.3　發(fā)酵罐培養

7.3.1　培養基配制、滅菌和裝料方法同7.2條。

7.3.2　接種

　　在無(wú)菌條件下將種子罐的細菌培養液，按1%的比例接種于冷卻至28℃的發(fā)酵罐內進(jìn)行培養。

7.3.3　發(fā)酵罐培養條件的控制

　　同7.2.6條。

7.3.4　培養過(guò)程中的檢測

　　接種后22h開(kāi)始，每隔2h取樣一次檢測，包括菌體生長(cháng)狀況、含菌量等，當含菌量達到1.0×10⁹ CFU /ml以上（根據生產(chǎn)需要確定菌液濃度），即可對發(fā)酵罐內菌液進(jìn)行滅活。

7.3.5　檢測指標與方法

　　同7.2.7條。

7.4　滅活

7.4.1　滅活方法

　　將發(fā)酵罐內細菌培養液加入福爾馬林，使福爾馬林最終濃度為0.15%，在4℃條件下滅活48h或25℃條件下滅活24h。在滅活過(guò)程中，每天充分攪拌（2～3）次。滅活后的菌液即為魚(yú)類(lèi)嗜水氣單胞菌滅活疫苗。

7.4.2　無(wú)活菌檢驗

　　在無(wú)菌條件下，取10ml滅活后的疫苗，用生理鹽水將待檢疫苗稀釋10倍，吸取0.2ml分別接種到肉湯蛋白胨液體培養基、厭氣肉肝湯培養基上各一管，在37℃條件下培養48h，均應無(wú)菌生長(cháng)。如有菌體生長(cháng)，則為滅活不徹底，為不合格產(chǎn)品。

8　安全性檢測

8.1　試驗容器

8.1.1　選用容積為（1～2）m³的水泥池或水簇箱等容器。容器需配有控溫和通氣增氧裝置。

8.1.2　容器在使用前用萬(wàn)分之一的漂白粉水溶液消毒24 h，消毒后用自來(lái)水沖洗干凈，并放入適量經(jīng)活性碳處理的自來(lái)水曝氣24h后待用。

8.2　試驗魚(yú)種

選用體重為100g左右，體質(zhì)健壯，游動(dòng)活潑，無(wú)任何損傷和疾病的鯽魚(yú)，在試驗前用2%的食鹽水浸�。�5～10）min, 將魚(yú)種放入符合8.1條規定的容器中，于（28～30）℃水溫下飼養，觀(guān)察15d，所有魚(yú)均應活動(dòng)正常。如發(fā)現有魚(yú)種出現有細菌性敗血癥癥狀，則該批魚(yú)種不得使用。

8.3　安全性試驗

取符合8.2條規定的鯽魚(yú)60尾，設實(shí)驗組和對照組，各30尾魚(yú)。將疫苗用無(wú)菌注射器對實(shí)驗組魚(yú)種作胸腔注射，注射劑量為0.5 ml /尾（疫苗濃度1.0 X10⁹ CFU / ml）。對照組注射等量生理鹽水。將魚(yú)種在（25～28）℃水體中飼養，觀(guān)察15d，如發(fā)現實(shí)驗組魚(yú)患細菌性敗血癥，而對照組魚(yú)為陰性，則該批疫苗為不合格產(chǎn)品。

9　效力檢驗

9.1　魚(yú)種免疫

9.1.1　按8.1條規定準備試驗容器，按8.2條規定選擇試驗魚(yú)種。

9.1.2　將符合安全試驗的待檢樣品用無(wú)菌生理鹽水稀釋成含菌量為1.0 X10⁹ CFU / ml，用無(wú)菌注射器對魚(yú)種進(jìn)行免疫注射，每尾腹腔注射劑量為0.3ml，試驗魚(yú)種不少于30尾。第三天再用同劑量疫苗強化免疫，注射后的魚(yú)種在（25～28）℃的水溫下飼養30d,該批魚(yú)種即為免疫魚(yú)種。

9.2　免疫魚(yú)攻毒

在無(wú)菌條件下將試管斜面嗜水氣單胞菌苔刮下制成菌懸浮液，含菌量為1.0 X10⁸ CFU /ml。以0.3m L/尾的劑量，分別注射經(jīng)免疫的試驗組魚(yú)種和未經(jīng)免疫的對照組魚(yú)種（試驗組和對照組的魚(yú)種數量相同，每組數量不少于30尾）。攻毒后的魚(yú)種在（25～28）℃的水體中觀(guān)察15d，記錄各組的死亡魚(yú)數，計算死亡率。

9.3　免疫保護率的計算

根據9.2條的試驗結果，計算其免疫保護率。

免疫保護率(%)=（對照組魚(yú)種死亡率一試驗組魚(yú)種死亡率）/對照組魚(yú)種死亡率×100%

注: 免疫保護率在65%以上的制品為合格品。

10　產(chǎn)品分裝與保存

　　將滅活、安全性和效力檢測合格的疫苗在無(wú)菌條件下，分裝于50ml或100ml經(jīng)消毒處理的玻璃瓶或塑料瓶中，加貼標簽，包裝產(chǎn)品。產(chǎn)品包裝按GB 6388的要求執行。疫苗產(chǎn)品置于4℃環(huán)境下冷藏備用，有效期為90d。在疫苗保存期間，應不定期進(jìn)行無(wú)活菌檢驗，以保障疫苗的安全性。

11　留樣待檢

　　每批產(chǎn)品留樣(3～5)瓶，保存90d。

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