幾種因素對噬菌體侵染大腸桿菌的影響研究

幾種因素對噬菌體侵染大腸桿菌的影響研究

摘要：通過(guò)利用λ噬菌體對大腸桿菌烈性侵染特性，研究了宿主生理狀態(tài)、pH、宿主數量、金屬離子及表面活性劑等外界因素對侵染過(guò)程的影響，結果表明：宿主生理狀態(tài)最為重要，指數分裂期的宿主細胞最易受到侵染；pH6～8的中性條件下有利于噬菌體吸附增殖； 100mg/L鈣、鎂離子能夠促進(jìn)吸附侵染過(guò)程；100mg/L鐵離子和0.2%吐溫80能夠抑制吸附侵染過(guò)程。

關(guān)鍵詞：噬菌體； 大腸桿菌 ； 宿主；侵染

噬菌體（Bacteriophage）是一類(lèi)專(zhuān)性寄生的原核生物病毒，分布廣泛于土壤、空氣、水中或生物體內。根據噬菌體與宿主細胞的關(guān)系可分為烈性噬菌體（virulent phage）和溫和噬菌體（temperate phage）兩大類(lèi)^[1]。噬菌體對發(fā)酵工業(yè)危害巨大^{[ 2-4]}，本文以λ噬菌體為模式病毒，研究幾種外界因素對噬菌體侵染宿主規律的影響。

1  材料和方法

1.1.   材料

1.1.1  菌種： E.colik₁₂Sgal^-（簡(jiǎn)稱(chēng)負菌）、E.colik₁₂F₂gal^-/λgal⁺/λ（簡(jiǎn)稱(chēng)正菌）

1.1.2　培養基及緩沖溶液

液體肉湯培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，pH7.2

上層半固體培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂0.6 %，pH7.2

下層固體培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.8%，pH7.2

加鎂磷酸緩沖液：KH₂PO₄ 2g ,K₂HPO₄ 7g ,MgSO₄.7H₂O 0.25g ,蒸餾水1000mL

1.2.   方法

1.2.1  λ噬菌體裂解液的制備^[5]

     液體肉湯培養基將正菌活化18h，離心收集菌體，緩沖液洗滌，紫外線(xiàn)照射10s～15s，黑暗培養3h，加入0.4mL氯仿劇烈振蕩30s～60s，靜止5min。離心（4000r/min）15min,上清液分別移入試管中,此液即為λ噬菌體裂解液。再次侵染負菌得到噬菌體富集液。

_________________

1.2.2噬菌體效價(jià)的測定

采用雙層平板法，將下層固體培養基倒平板凝固為底層平板，液體肉湯培養液將噬菌體裂解液10倍稀釋至10^-7，5mL融化的上層半固體培養基冷卻至45℃左右，分別加入0.5mL負菌敏感菌液，同時(shí)加入0.2mL不同稀釋度的噬菌體裂解液，迅速傾于底層平板上，輕輕搖勻，待凝固后，置37℃培養24h。統計平板上形成的噬菌斑數量，并計算其效價(jià)（噬菌體個(gè)數/ml）。

2 結果與分析

正菌菌株是整合λ噬菌體的溶源性大腸桿菌，負菌菌株的λ噬菌體整合能力缺失，因此正菌菌株經(jīng)紫外線(xiàn)誘導后裂解的λ噬菌體，對負菌菌株則表現為烈性噬菌體的侵染效果。

2.1 紫外誘導大腸桿菌正菌裂解噬菌體的效價(jià)

經(jīng)紫外誘變，正菌被裂解形成的噬菌體裂解液效價(jià)為： 2.743×10⁷個(gè)/mL

經(jīng)負菌擴增得到的噬菌體富集液的效價(jià)為：1.097×10⁹ 個(gè)/mL 

2.2大腸桿菌的生理狀態(tài)對噬菌體侵染的影響

噬菌體在固體平板上侵染宿主能夠形成基本固定大小的噬菌斑，一般12h左右噬菌斑直徑大小不再擴展，說(shuō)明噬菌體對宿主的侵染是有限制的，這種限制是否與大腸桿菌的生理狀態(tài)有關(guān)？將大腸桿菌負菌接種于液體肉湯培養基中，并等分到8個(gè)三角瓶中，37℃搖瓶培養，并每隔2h，取出一瓶接入稀釋的噬菌體，,同時(shí)無(wú)菌培養基接入噬菌體為對照，繼續培養到30h，分別稀釋后雙層平板法觀(guān)察噬菌體數量，結果見(jiàn)表1。

 以對照的噬菌斑結果為陰性結果，則表1顯示出前12h噬菌體能夠良好侵染宿主，而這個(gè)時(shí)期正是宿主的快速分裂期，12h后宿主進(jìn)入穩定期，侵染力也隨之喪失，充分說(shuō)明了噬菌體對宿主的侵染與宿主的生理狀態(tài)有關(guān)，這與固體平板上噬菌斑長(cháng)到一定大小時(shí)不在擴展的結果是一致的。

表1  生理狀態(tài)對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大于300，

2.2 pH對噬菌體侵染的影響

配制不同pH的上層半固體肉湯培養基， 45℃水浴保溫，分別加入0.5mL的敏感菌液，同時(shí)加入0.2mL的噬菌體稀釋裂解液，搖勻后，雙層平板觀(guān)察噬菌斑生長(cháng)情況。

表2 pH對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大于300  ++代表噬菌斑數大于200  –代表無(wú)噬菌斑生成

表3結果表明pH6.0～8.0時(shí)，大腸桿菌生長(cháng)良好，同時(shí)也適合λ噬菌體的侵染。

2.3 敏感菌的數量對噬菌體侵染造成的影響

取6支已滅好菌的半固體肉湯培養基，分別加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL的敏感菌液，同時(shí)迅速加入稀釋的0.2mL的噬菌體裂解液，搖勻迅速傾于底層為肉湯固體培養基平板上，輕輕搖勻，待凝固后，置37℃培養24h。

表3  敏感菌的數量對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大于300

由表3可知，不同量的敏感菌液對噬菌斑數量沒(méi)有明顯影響。

2.4 金屬離子濃度對噬菌體侵染造成的影響

在上層半固體培養基中分別加入不同濃度的不同金屬離子，再接入稀釋的噬菌體和宿主，觀(guān)察噬菌斑數量，以無(wú)離子為對照。

表4  金屬離子濃度對噬菌體侵染的影響

注：+代表噬菌斑數小于200  ++代表噬菌斑數大于200  +++代表噬菌斑數大于300

由表4可知，100mg/L的Ca²⁺ 、Mg²⁺能夠促進(jìn)噬菌斑的生成，而100mg/L的Fe²⁺則減少了噬菌斑生成，表明Ca²⁺ 、Mg²能夠促進(jìn)噬菌體對宿主的吸附，而Fe²⁺則抑制噬菌體對宿主的吸附，而其他的金屬離子K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等則對噬菌體吸附?jīng)]有明顯的作用。

2.5  表面活性劑（吐溫80）對噬菌體侵染造成的影響

半固體肉湯培養基中，加入0.2%的吐溫80，同時(shí)加敏感菌液和噬菌體裂解稀釋液，搖勻并迅速傾于底層培養基平板上，輕輕搖勻，待凝固后，置37℃培養24h，觀(guān)察噬菌斑生長(cháng)情況。

表 活性劑（吐溫80）對噬菌體侵染的影響

注：+代表噬菌斑數小于200  ++代表噬菌斑數大于200

由表5可知，加入吐溫80后，噬菌斑減少，由于吐溫80是表面活性劑，因此主要作用應該是減少了噬菌體對細菌細胞膜的吸附作用。

3 結  論

平板培養基上的噬菌斑長(cháng)到一定程度，就不再繼續擴大，表明噬菌體對敏感菌株的侵染受到了一定的限制。研究了宿主的生理狀態(tài)、環(huán)境pH、敏感菌數量、金屬離子濃度、表面活性劑等因素對噬菌體侵染大腸桿菌的影響，得出結論如下：（1）噬菌體侵染宿主時(shí)，宿主的生理狀態(tài)最為重要，處于指數分裂期的大腸桿菌更易被噬菌體侵染；（2）在pH6～8的中性條件下有利于噬菌體吸附增殖，而在過(guò)酸和過(guò)堿的情況下不易增殖；（3）一定條件下，敏感菌的數量對噬菌體的侵染影響不大；（4）較高濃度（100mg/L）的Ca²⁺、Mg²⁺對噬菌體的吸附增殖有促進(jìn)作用；而同濃度的Fe²⁺對噬菌體的吸附增殖有阻礙作用，（5）0.2%表面活化劑吐溫80可以破壞敏感菌的細胞膜，從而影響了噬菌體的吸附增殖。 該結論可能為降低發(fā)酵工業(yè)中噬菌體感染提供了一定的思路。

 參考文獻:

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[4] 劉瓊, 賴(lài)濱霞,廖付榮.卡那霉素抗噬菌體生產(chǎn)菌株的選育及應用[J] .福建畜牧獸醫 2004, 26(2)：3-4

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