EHEC增菌培養基對O157：H7大腸桿菌增菌效果的觀(guān)察

觀(guān)察增菌培養基對 O157：H7 大腸桿菌的增菌效果。以實(shí)驗室常用方法測定目的菌及非目的菌在增菌培養基中生長(cháng)的靈敏度及選擇性，比較幾種培養基對糞便標本中O157：H7的檢出率。實(shí)驗證明，N·m EHEC培養O157：H7大腸桿菌及非目的菌， 出現可見(jiàn)生長(cháng)的最低接種濃度( cfu／m1)，前者明顯小于后者，呈現良好的選擇性，對糞便標本中O157：H7的檢出率 N·mEHEC明顯高于N·mEC。 N · mEC對O157：H7大腸桿菌具有良好的選擇性增菌作用，可著(zhù)提高感染人群和污染標本O157：H7菌的檢出率。

O157：H7是腸出血性大腸桿菌的常見(jiàn)血清型，給人類(lèi)帶來(lái)的危害是眾所周知的，已引起醫療、衛生等部門(mén)的高度重視，衛生部下達的“腸出血性大腸桿菌O157：H7的監測方案”明確規定，O157：H7，感染腹瀉按《傳染病防治法》乙類(lèi)傳染病進(jìn)行報告和疫情處理。然而，病例的確診取決于病原學(xué)、血清學(xué)的檢 驗結果，直接分離，陽(yáng)性率極低。到目前為止，國內尚無(wú)理想的專(zhuān)用培養基。檢索發(fā)現，大多采用EC肉湯加新生霉素進(jìn)行培養，近來(lái)又有EHEC菌培養基推出 ，為了更有效地選擇增菌培養基，以提高O157：H7，大腸桿菌的檢出率，我們應用市售的mEC及 mEHEC 對O157：H7增菌效果進(jìn)行了實(shí)驗比較，現報道如下 。 

1 材料

1.1菌株所試27株菌中，1-6號為O157：H7，大腸桿菌(均山梨醇一)，7-16號為普通大腸桿菌，1718號為變形桿菌，l 9-20號為克雷伯菌，21-22號為志賀菌，2324號為沙門(mén)菌，25號為檸檬酸桿菌，26號為陰溝桿菌，27號為金黃色葡萄球菌，其中l、5、7、8、9、17、19號為標準菌株，所有菌株均由本站菌種室提供 。

1.2 主要試劑新生霉素為SIGMA公司生產(chǎn)，O157和H7，診斷血清由蘭州生物制品研究所和衛生部流研所生產(chǎn)。

1.3 mEHEC培養基：山東省衛生防疫站培養基室提供半成品( 加新生霉素后簡(jiǎn)稱(chēng)N-mEHEC)，按說(shuō)明書(shū)制備應用。

1.4 mEC培養基：選用兩種，分別來(lái)自北京和上海兩家培養基廠(chǎng)家的半成品 (加新生霉素后分別簡(jiǎn)稱(chēng) N- mECj和N- mECs ) 按說(shuō)明書(shū)制備應用。

1.5 其他培養基：普通肉湯、營(yíng)養瓊脂、麥康凱瓊脂( MAC)、山梨醇麥康凱瓊脂(SMAC)，均為山東省衛生防疫站培養基室生產(chǎn)的半成品，按說(shuō)明書(shū)制備應用。

2 方法

2.1 增菌培養基的比較

2.1.1細菌生長(cháng)的靈敏度比較

 ( 1 )分別取mECj、mECs及mEHEC培養基半成品，按使用說(shuō)明配制，后加入相同劑量的新生霉素至培養基最終含量為20mg／L，無(wú)菌分裝每管備用。

( 2 )將試驗菌株37℃ 6h肉湯培養物以無(wú)菌生理鹽水做10倍系列稀釋?zhuān)�并以瓊脂平板法測定其濃度(cfu／ m1 )，取 10^-4—10^-85個(gè)稀釋度各lml×3，分別接種于3種增菌液各1支，37 ℃培養20h后，記錄呈現可見(jiàn)生長(cháng)的最低接種濃度( cfu／m1 )。 

2.1.2 選擇性試驗

( 1 )分別將1號( O157：H7標準菌株)及8，10，13，16，17，19，26號菌株37 ℃ 6h肉湯培養物以無(wú) 菌生理鹽水做10倍系列稀釋?zhuān)�并以平板法測定細菌濃度( cfu／m1 )。取 1號菌10^-6稀釋度2ml ×7分別與 8， 10，13，l6，17，19號菌的10^-3稀釋度等量混合，與26號菌10^-4稀釋度等量混合，制成O157：H7菌與上述某一菌株的混合菌液。 

( 2 )取上述混合菌液 l ml ×3，分別接種于( 1 ) 所制備3種增菌培養基各1支，充分混勻，于培養前和培養后( 37 ℃2Dh )分別定量劃線(xiàn)于鑒別瓊脂平板(變形桿菌用MAC平板，其他6株菌用SMAC平板)，培養后計數兩種菌落。

2.2對糞便標本增菌效果的比較

 將健康人大便 2g乳化于20ml無(wú)菌生理鹽水中，并用瓊脂平板法測定含菌濃度( cf u／m1 ) 。取該懸液l m l ×12分別接種N· mEHEC、N·mECj、N·mECs各4支。將1菌37℃6h肉湯培養物以無(wú)菌生理鹽水做10倍系列稀釋?zhuān)�并用瓊脂平板法測定其濃度(cfu／m1 )，取10^-3 — 10^-6 4個(gè)稀釋度各 l ml ×3，分別接種含大便懸液的3種增菌培養基各1支，充分混勻，于培養前和培養后( 37℃ 20h ) 各取一菌環(huán)( d3mm)劃線(xiàn)于SMAC平板，培養后挑選無(wú)色菌落，用O157和H7診斷血清做玻片凝集。

3 結果

3.1 三種增菌培養基對細菌生長(cháng)的靈敏度試驗：其中9，12，15，17，18，19，20，22，23，27號菌株，其最大接種濃度( 10⁴— 10⁵ cfu／m1 ) 均未見(jiàn)生長(cháng)，其他菌株呈現可見(jiàn)生長(cháng)的最低接種濃度見(jiàn)表 1 。

表 1 三種增菌培養基的比較

注： 表中數字 1m l 接種量呈現可見(jiàn)生長(cháng)的最低濃度( cfu／m1 ) ，-表示最大接種濃度( 11號為 6×10⁴ ， 13號為9×10⁴ cfu／m 1 ) 仍未見(jiàn)生長(cháng) 。 

3.2 三種增菌培養基對O157：H7大腸桿菌和非目的菌的選擇性試驗：增菌前所劃各平板生長(cháng)的非目的菌菌落數為48 —204個(gè)，均未檢出O257：H7菌，增菌培養后，O157：H7與非目的菌在所劃平板上的菌落數見(jiàn)表2。 

表 2 三種增菌培養基選擇性增菌效果比較

注： * 增菌前 O 157：H7，大腸桿菌與非目的菌菌量之比；**表中分子為增菌后O157：H 7菌落數，分母為非目的菌菌落數。

3.3對糞便標本增菌效果比較：增菌前經(jīng)SMAC瓊脂分離培養，3種增菌培養基對40份糞便標本O157：H7菌檢出率近似，只在 1：90-200 ( O157：H7菌：大便細菌) 時(shí)檢出37.5％-40％，經(jīng)37℃ 20h 增菌培養后，檢出結果見(jiàn)表3 。 

表 3 三種增菌培養基對 40份糞便模擬標本增菌效果比較

*大便懸液 1m1 ( 各糞便標本平板法計數為5.4×10⁶ —1.2 ×10⁷ cfu/ m1 ) 分別加入O157：H7菌液 6×104、 6×l0³、6×10²、60cfu／ml  各1ml。 

4 討 論

結果證明，對 O157：H7大腸桿菌增菌效果，依次為N· mEHEC、N.mECj 、N.mECs ；對非目的菌抑菌效果：所試葡萄球菌、變形桿菌、克雷伯菌，在3種培養基中均受到良好抑制，對所試檸檬酸桿菌， 陰溝桿菌均無(wú)明顯抑菌作用，對普通大腸桿菌，則表現了不同培養基對不同菌株抑菌效果的差異性(見(jiàn)表 1 ) ，以NmEHEC抑菌效果最佳。通過(guò)3種培養基對糞便模擬標本的對比檢測表明，增菌培養后，其O157： H7，大腸桿菌的檢出率，N· mEHEC明顯高于兩種N mEC(見(jiàn)表3 ) ，而培養前3種培養基只在l：90—200 (O157：H7，菌：大便中非目的菌) 時(shí)檢出率分別為37.5％、37.5％、40％，三者無(wú)顯著(zhù)差異。

進(jìn)一步檢測發(fā)現，當3種培養基不加新生霉素時(shí)，所試O157：H7，菌株呈現可見(jiàn)生長(cháng)的最低接種濃度近似，對非目的菌的抑菌效果，除葡萄球菌均被抑制外，只有N．mEHEC對11號、13號大腸桿菌和變形桿菌有不同程度的抑菌作用。當加入新霉素至20 mg／L時(shí)，三種培養基除有效地抑制大部分非 目的菌外，對O157：H7，菌的增菌效果出現明顯差異( 見(jiàn)表 1 ) ，以NmEHEC增菌效果最佳。

我們在EC肉湯中不加膽鹽，只加相同劑量的新生霉素 ( 20mg／L )，則O157：H7菌均受到不同程度的抑制。當膽鹽量為1.5g／L時(shí)，所試 Ol57：H7菌株生長(cháng)情況與N · mECs近似；膽鹽量增至5g／L時(shí)， 與 N·mECj近似；膽鹽含量加至8 g／L時(shí)，與 N·mEHEC結果近似。由此可見(jiàn)，在一定范圍內，適當增加膽鹽用量，不僅可有效抑制部分非目的菌的生長(cháng)，也可減弱或消除新生霉素對 O157：H7的抑菌作用，從而加強對目的菌的增菌效果 。

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