藍細菌制氫研究進(jìn)展（2）

藍細菌產(chǎn)氫的環(huán)境條件藍細菌產(chǎn)氫需要適宜的環(huán)境條件，包括光強、溫度、鹽度、氣相組成和培養基營(yíng)養組成等。對于固氮酶介導的放氫，由于固氮酶活性比最優(yōu)生長(cháng)要求更高的飽和光強，適當提高光強往往可以增大產(chǎn)氫。對于異形胞藍細菌，由于吸氫酶可消耗固氮酶放出的氫，N₂是固氮酶放氫的競爭性抑制劑，O₂可導致可逆氫酶失活，并促進(jìn)氧氫反應。藍細菌在空氣條件下放氫微弱，難以被檢測到，所以藍細菌放氫一般在氬氣環(huán)境中進(jìn)行，或在空氣或氮氣中補充固氮酶和吸氫酶的氣體抑制劑（CO和C₂H₂）進(jìn)行。另外，添加有機碳化合物往往可以促進(jìn)放氫，外源氮源的存在則可抑制固氮酶合成和產(chǎn)氫。

固定化培養可以保護藍細菌細胞及其酶的活性，降低其因受環(huán)境條件干擾而導致的失活，從而提高其產(chǎn)氫的速率和穩定性。藍細菌固定化培養最常用的載體包括瓊脂凝膠、藻酸鹽凝膠、聚氨酯泡沫和聚乙烯泡沫。Park等在一柱式光生物反應器中采用聚乙烯泡沫固定的A. azollae實(shí)現了連續6d產(chǎn)氫，Markov等利用中空纖維固定的A. variabilis實(shí)現了5個(gè)月連續產(chǎn)氫，產(chǎn)氫速率為0.02-0.2 ml H₂ mg 干重^-1 h^-1。采用連續培養也可以提高藍細菌產(chǎn)氫的速率和穩定性，Lichtl等［13］采用恒化系統對N. flagelliforme進(jìn)行連續培養，以利用其在對數生長(cháng)期較高的固氮酶活性，結果在連續培養條件下產(chǎn)氫速率可達分批培養的4倍之多。

采用某些生理生化方法可以顯著(zhù)促進(jìn)藍細菌產(chǎn)氫。異形胞藍細菌的凈放氫是固氮酶放氫和吸氫酶耗氫的結果，提高固氮酶活性或抑制吸氫酶活性都有利于產(chǎn)氫的增加。含釩不含鉬的培養條件可以誘導某些藍細菌表達放氫效率更高的釩固氮酶，從而可以產(chǎn)生更大量的氫氣。Dawar等發(fā)現在培養基中提高鎂離子濃度和添加果糖，Nostoc sp. ARM 411異形胞頻率可以增大3倍，其固氮酶活性和產(chǎn)氫能力亦相應提高。藍細菌吸氫酶輔基中包含鎳，鎳是吸氫酶合成和具有催化活性的必需組成，采用鎳限制條件可以抑制吸氫酶活性，從而顯著(zhù)促進(jìn)產(chǎn)氫。另外，同步培養也可能成為促進(jìn)藍細菌Synechococcus sp.產(chǎn)氫的途徑。

一些主要的有利于藍細菌產(chǎn)氫的策略見(jiàn)表2。

表2促進(jìn)藍細菌產(chǎn)氫的策略

4菌株篩選和突變株構建

藍細菌具有廣泛多樣的生存環(huán)境和遺傳背景，考察不同生境來(lái)源的藍細菌可能分離獲得具有高產(chǎn)氫能力的菌株。不過(guò)，篩選高產(chǎn)菌株的研究還不多見(jiàn)。Howarth等比較了9株單細胞不固氮藍細菌的放氫和吸氫能力。Kumar等分離了11個(gè)屬20個(gè)種的固氮和不固氮藍細菌，考察了它們的生理特征和在不同條件下的產(chǎn)氫能力。結果發(fā)現，Nostoc屬和Anabaena屬各有1個(gè)種表現出依賴(lài)于光和固氮酶的好氧產(chǎn)氫能力。在Ar + 1% CO₂下培養時(shí)，所有檢測菌株均可產(chǎn)氫。3個(gè)屬（Plectonema、Oscillatoria和Spirulina）的藍細菌表現出依賴(lài)于甲基紫精即依賴(lài)于氫酶的產(chǎn)氫能力。

采用化學(xué)誘變或基因工程方法，使吸氫酶基因失活，可以使固氮酶放出的氫不被氧化回收，從而提高藍細菌氫的產(chǎn)率。Mikheeva等采用亞硝基胍誘變方法獲得兩株A. variabilis ATCC 29413氫代謝缺陷突變株PK84（吸氫酶和可逆氫酶缺陷）和PK17R（吸氫酶缺陷），它們的生長(cháng)特征和異形胞頻率與野生型相同，但放氫速率顯著(zhù)提高。在連續培養PK84和PK17R時(shí)，它們產(chǎn)氫的速率分別是野生型的4.3倍和1.4倍，并且在氮營(yíng)養壓力條件下（當N₂由25%下降至5%時(shí)），其產(chǎn)氫速率分別達到167.60和59.18μmol H2 mg chl a^-1h^-1。Happe等構建的hupSL缺失的A. variabilis ATCC 29413吸氫酶缺陷株AVM13，在固氮條件下產(chǎn)氫速率顯著(zhù)增大（68μmol H₂ mg chl a-1 h-1），比野生型高3倍。Lindberg等對缺少可逆氫酶的N. punctiforme ATCC 29133采用插入突變構建了hupL�餐蛔冎�，從而獲得一不具有任何氫酶的菌株NHM5。將NHM5在固氮條件下培養，可以觀(guān)察到其能夠在空氣條件下放氫（14μmol H₂ mg chl a^-1 h^-1），而野生型則不放氫。Masukawa等構建了3株Anabaena sp. PCC 7120的氫酶突變株，即吸氫酶缺陷株hupL、可逆氫酶缺陷株hoxH和雙重缺陷株hupL/hoxH，結果發(fā)現，hupL和hupL/hoxH突變株產(chǎn)氫量相當，最大產(chǎn)氫速率是野生型的4-7倍，hoxH�餐蛔冎戤a(chǎn)氫量則比野生型低15%-33%。他們認為，是吸氫酶基因的破壞，而不是可逆氫酶基因的破壞，促進(jìn)了Anabaena sp. PCC 7120氫的產(chǎn)生。藍細菌吸氫酶缺陷突變株的高產(chǎn)氫能力使它們在光生物反應器產(chǎn)氫的研究中獲得了應用，其產(chǎn)氫能力亦被進(jìn)一步證實(shí)。

5藍細菌在光生物反應器中產(chǎn)氫

藍細菌產(chǎn)氫在光生物反應器中的放大是其走向應用的必經(jīng)環(huán)節。簡(jiǎn)易高效的光生物反應器的設計是藍細菌產(chǎn)氫研究的一個(gè)重要方面，光生物反應器產(chǎn)氫特征的研究將為藍細菌大規模產(chǎn)氫提供依據。關(guān)于藍細菌在光生物反應器中產(chǎn)氫已進(jìn)行了一些很有意義的探索性研究。藍細菌產(chǎn)氫光生物反應器主要采用管式光生物反應器，另有采用柱式等光生物反應器的報道。反應器培養采用的菌株主要是少數Anabaena屬藍細菌，尤其是A. variabilis及其吸氫酶缺陷突變株PK84。

Tsygankov等采用10 mm內徑的聚氯乙烯管制成一實(shí)驗室規模的4.35 L螺旋狀管式光生物反應器，此反應器具備較大的表面積/體積比（200 m^-1）以及良好的生化和環(huán)境參數的計算機控制系統，模型實(shí)驗證明了反應器高速率產(chǎn)氫的可能性。Tsygankov等考察了A. variabilis ATCC 29413及其吸氫酶缺陷突變株PK84在上述管式光生物反應器中分批培養時(shí)產(chǎn)氫的特征。Borodin等研究了在此光生物反應器中，在12 h光照（36 ℃）和12 h黑暗（14-30℃）交替進(jìn)行模擬戶(hù)外自然條件的情況下，利用A. variabilis PK84產(chǎn)氫的特征，結果PK84在2.5個(gè)月連續培養過(guò)程中可以穩定產(chǎn)氫，對應于細胞密度3.6-4.6μg chl a ml^-1，最大產(chǎn)氫量為230 ml H₂ 12h光照^-1 PhBR^-1。

Fedorov等首次在完全戶(hù)外條件下在4.35L螺旋狀管式光生物反應器中培養A. variabilis PK84。分批培養時(shí)，最大產(chǎn)氫速率達到80 ml H₂ h^-1 PhBR^-1，反應器最大光能氫能轉化效率在陰天和晴天分別為0.33%和0.14%；連續培養時(shí)，產(chǎn)氫速率在36d實(shí)驗過(guò)程中可以維持在25-35 ml H₂ h-1 PhBR-1。Tsygankov等進(jìn)一步研究了在戶(hù)外條件下A. variabilis PK84在4.35L光生物反應器中產(chǎn)氫的特征，連續培養時(shí)，氫的產(chǎn)量可達1.1LH₂ d^-1 PhBR^-1，最高光能氫能轉化效率可達到0.094%。他們發(fā)現，產(chǎn)氫速率和光能轉化效率主要依賴(lài)于溫度（在14-30 ℃范圍內）和光強，溫度提高可明顯促進(jìn)氫的產(chǎn)生和光能轉化效率的提高，光強增大對產(chǎn)氫有促進(jìn)作用，但對光能轉化效率有負的影響。這些結果證明了利用A. variabilis PK84在戶(hù)外自然條件下在光生物反應器中產(chǎn)氫的可能性。

另外，Lindblad等在1.9L計算機控制的管式光生物反應器中連續培養Anabaena PCC 7120及其吸氫缺陷突變株AMC414，結果表明，突變株產(chǎn)氫速率高于野生菌株，它們的最大產(chǎn)氫速率分別為45和20μmol H₂ mg chl a^-1h^-1，突變株在通空氣條件下仍可產(chǎn)氫，并且產(chǎn)氫速率隨光強增大而增大。他們在4.35L螺旋狀管式光生物反應器中在戶(hù)外條件下培養AMC414，AMC414表現出持續產(chǎn)氫能力，最大產(chǎn)氫為14.9ml H₂ l^-1h^-1,太陽(yáng)能轉化為氫能的最大效率為0.042%。

6結論

利用藍細菌產(chǎn)氫是理想的生物制氫方式之一。藍細菌產(chǎn)氫取決于菌株的遺傳背景和產(chǎn)氫的環(huán)境條件。目前，藍細菌氫的產(chǎn)率和光能轉化效率尚未達到實(shí)際應用的要求，但已進(jìn)行的研究工作為進(jìn)一步提高藍細菌產(chǎn)氫的效率奠定了基礎。藍細菌產(chǎn)氫的主要障礙在于：產(chǎn)氫的酶受氧的抑制，產(chǎn)生的氫被吸氫酶消耗，以及氫的產(chǎn)率較低。固氮酶放氫的效率因酶本身的低周轉率、高ATP需求和對氧的敏感性而受到嚴重的影響。另外，籃細菌細胞因適應低光強條件而具有的較高的色素含量，使其在高光強下光合作用效率降低，產(chǎn)氫效率亦降低。提高藍細菌產(chǎn)氫效率需要在藍細菌遺傳、生理和培養等方面進(jìn)行深入的研究，這包括分離和研究更多新的藍細菌，如采用時(shí)間分離策略進(jìn)行光合和固氮的藍細菌、共生固氮的藍細菌以及具有異養能力的藍細菌等，以獲得具有更高固氮酶或放氫氫酶活性的藍細菌菌株；對藍細菌進(jìn)行基因工程改造，如使吸氫酶失活、使固氮酶和放氫氫酶對氧穩定和高水平表達、降低細胞色素含量等；以及對產(chǎn)氫培養條件進(jìn)行優(yōu)化，包括某些生理調節方式的采用和適宜的光生物反應器的設計。值得注意的是，藍細菌可逆氫酶在進(jìn)行催化作用時(shí)僅需要較少的代謝能量，在理論上具有比固氮酶更強的放氫能力，藍細菌可逆氫酶的放氫能力值得深入研究和利用�？梢云谕�，隨著(zhù)對可再生清潔能源的關(guān)注，藍細菌制氫研究將取得迅速進(jìn)步。

參考文獻：略

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