革蘭陰性桿菌分科顯色培養基的效果評價(jià)

革蘭陰性桿菌分科顯色培養基的效果評價(jià) 

盧先雷  潘露   

[摘要] 

目的 為縮短G^-b的鑒定時(shí)間，提高報告速度，作者設計了一種集分離鑒定于一體的分科顯色培養基NBIIA（negative bacilli isolation and identification agar），評價(jià)該培養基對于革蘭陰性桿菌分離率和分科鑒定的準確性。

方法  檢測NBIIA對腸桿菌科、非發(fā)酵菌、弧菌科的菌共39株不同種屬的已知細菌的分科鑒定結果與金標準（OF+氧化酶）鑒定結果的一致率；采用（NBIIA+氧化酶）與（OF+氧化酶）對照，NBIIA與MC（麥康凱瓊脂）對照，對830份臨床標本（大便標本除外）進(jìn)行檢測，統計分離率差異及陽(yáng)性標本分科鑒定一致率。

結果  三科39株細菌分科鑒定一致率：腸桿菌科90%，非發(fā)酵菌100%，弧菌科80%； NBIIA與MC對830份標本G^-b的分離率各為19.9%、19.3%；二者一致率98.0%，（NBIIA+氧化酶）與（OF+氧化酶）對陽(yáng)性標本中G^-b的分科鑒定一致率97.8% 。

結論  NBIIA的分離效果與傳統MC差異不具顯著(zhù)性，但由于集分離鑒定于一體，可不必經(jīng)過(guò)（OF+氧化酶）這一鑒定步驟,有助于革蘭陰性桿菌的快速鑒定。

    在引起人類(lèi)感染的G^-b中，以腸桿菌科、非發(fā)酵菌、弧菌科細菌最為多見(jiàn)^[1-3]，但由于這三類(lèi)細菌形態(tài)特征相似，而實(shí)際所包含的屬、種數量又最為龐大，故鑒定過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(cháng)易出錯，影響了檢驗報告的速度，很不適應臨床的實(shí)際需要；而購置自動(dòng)化儀器無(wú)論設備或試劑都較昂貴，使成本大大增加，因而抬高了收費價(jià)格，增加了病人負擔^[4]。為了解決這一矛盾，作者研制了一種集分離鑒定于一體的G^-b分科顯色培養基，可在18h內將細菌分離并鑒定至科，現介紹如下：

1．材料與方法：

1.1 材料：

1.1.1蛋白胨、牛肉膏、麥康凱瓊脂、氧化酶、微量生化管等購自杭州天和微生物試劑廠(chǎng)，示胨、水解酪蛋白購自英國OXOID公司，糖類(lèi)、膽鹽、各種指示劑、NaCl等稍生物化學(xué)試劑為國產(chǎn)試劑。

1.1.2培養基：（1）麥康凱瓊脂（MC）：按規定用量配制，調整PH，121℃滅菌后，傾制平皿；（2）G^-b分科顯色培養基（NBIIA）：配方：營(yíng)養瓊脂38g、葡萄糖10g、豬膽鹽4g、Na₂HPO₄ 6g、KH₂PO₄ 2g、H₂O 1L，加熱溶解，調整PH 7.0后加入專(zhuān)用指示劑1ml(可用1%溴甲酚紫1.6ml代替)，煮沸滅菌后傾制平皿（不需高壓滅菌）。

1.1. 3菌株:分別來(lái)源于衛生部臨檢中心；四川省臨檢中心（質(zhì)控菌株）及臨床分離所得（經(jīng)API復檢定種）：

1.1.3.1腸桿菌科（20株）：大腸埃希氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、遲緩愛(ài)德華菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、聚團多源菌、蜂房哈夫尼亞菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、摩根摩根菌、奇異變形桿菌、雷極普羅威登菌、傷寒沙門(mén)菌、粘質(zhì)沙雷菌、普城沙雷菌、深紅沙雷菌、發(fā)光致病桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌、弗氏耶爾森菌。

1.1.3.2非發(fā)酵菌（14株）：銅綠假單胞菌、施氏假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、腐敗許諾旺菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌、腦膜炎敗血黃桿菌、產(chǎn)氣巴斯德菌、非液化莫拉菌、紫色色桿菌。

1.1.3.3弧菌科（5株）：副溶血弧菌、河弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、類(lèi)志賀鄰單胞菌。

1.1.4臨床標本：共830份：（1）來(lái)自我院住院和門(mén)診病人。標本類(lèi)型有：痰、尿、膿、宮頸分泌物、精液、前列腺液、咽拭子、血（先增菌）、眼拭子、組織、膽汁、燒傷創(chuàng )面分泌物、胸水（先增菌）、腹水（先增菌）、腦脊液（先增菌）等。（2）由于腸道菌群主要以腸桿菌科為主，弧菌、非發(fā)酵菌罕見(jiàn)，故而NBIIA對于大便標本的檢測意義不大，應加以排除。

1.2   方法：

1.2.1判斷方法與標準：

1.2.1.1NBIIA判斷方法：

腸桿菌科：黃色凸起菌落(某些菌屬在菌落聚集處呈藍色)，中心渾濁，直徑2.0mm-3.0mm（大）

    非發(fā)酵菌：蘭色扁平菌落(鮑曼不動(dòng)桿菌在菌落聚集處由于色素堆積而呈橙黃色，單個(gè)菌落無(wú)色但不透明)，透明或半透明，直徑1.0mm-2.0mm（�。�

               弧菌科：淡黃色扁平菌落，干燥不透明，直徑1.5mm-2.5mm（大）

1.2.1.2OF+氧化酶判斷方法：

腸桿菌科：發(fā)酵（F），氧化酶（-）

               非發(fā)酵菌：氧化/不利用（O/-），氧化酶（+/-）

               弧菌科：發(fā)酵（F），氧化酶（+）

1.2.1.3氧化酶+NBIIA判斷方法：

腸桿菌科：黃色凸起大菌落，氧化酶（-）

               非發(fā)酵菌：蘭色扁平小菌落（鮑曼不動(dòng)桿菌中等菌落），氧化酶（+/-）

               弧菌科：淡黃色干燥大菌落，氧化酶（+）

1.2.2實(shí)驗室評價(jià)：

采用以上39株已知細菌對NBIIA進(jìn)行測試，以OF+氧化酶試驗作為金標準，比較二者一致率，分別按科進(jìn)行統計；

1.2.3臨床應用試驗評價(jià)：

1.2.3.1NBIIA與MC平行測試，比較二者對于G^-b的分離率差異；

1.2.3.2NBIIA+氧化酶與OF+氧化酶平行測試，比較二者對于G^-b的分科鑒定一致率。

2.結果：

2.1對39株已知細菌分科鑒定一致率：見(jiàn)表1；

      腸桿菌科一致率：90%，其中沙雷菌屬由于紅色素干擾，以及生長(cháng)較快而不易判斷；

非發(fā)酵菌一致率：100%，其中鮑曼不動(dòng)桿菌為中等菌落，不透明，其余各菌均為小菌落，透明；

弧菌科一致率：80%，其中氣單胞菌由于菌落較大，黃色較深，易判斷為腸桿菌。NBIIA與氧化酶聯(lián)用時(shí)可避免誤判；

三大科總體一致率：92.3%；

2.2臨床應用評價(jià)結果：

2.2.1NBIIA與MC對于830份標本分離率比較：見(jiàn)表2

NBIIA分離率：19.9%;MC分離率：19.3%;二者一致率：98.0%; kappa=0.94, P<0.01;

2.2.2NBIIA+氧化酶與OF+氧化酶對G^-B的分科鑒定的比較：

 二者一致率：161/165=97.8%;

表1  39株已知G^-b采用NBIIA與OF+氧化酶鑒定結果

                     表2  NBIIA與MC對830份標本分離率比較

3.討論：

對臨床常見(jiàn)的三大類(lèi)G^-b的鑒定在以前很長(cháng)一段時(shí)間都是采用傳統的雙歧表流程操作，雖然鑒定較準確，但繁瑣費時(shí)，報告時(shí)間長(cháng)，很不適應臨床需要。國外從80年代開(kāi)始推廣編碼法生化鑒定系統，于90年代引入我國^[5]，近十年來(lái)又有酶法生化鑒定系統及在編碼法生化鑒定基礎上發(fā)展起來(lái)的自動(dòng)化儀器使鑒定速度大大加快。但即使如此也仍然跟不上臨床感染疾病的迫切需要�，F在所采用的編碼系統在應用前均應先經(jīng)分科鑒定，確定科級水平后才能應用相應的編碼體系，如此以來(lái)從分離培養到編碼鑒定之間36~48h的時(shí)間幾乎很難逾越^[6]，所以解決分科鑒定是縮短整個(gè)報告時(shí)間的關(guān)鍵所在。而作者根據腸桿菌、非發(fā)酵菌、弧菌對葡萄糖分解產(chǎn)酸能力強弱的不同、分解蛋白胨產(chǎn)堿相對產(chǎn)酸量的多少、及此三類(lèi)細菌對膽鹽的耐受能力的大小所研制的這種分科顯色培養基集分離鑒定于一體，很好地解決了這一問(wèn)題^[7-12]，且與傳統OF+氧化酶試驗有高度一致性。

在該培養基上，有很多細菌菌落形態(tài)具有十分獨特的特征，如肺炎克雷伯氏菌黃色偏白、黏液型特大菌落（３－５mm），臭鼻克雷伯氏菌為中等大小黃色膠水樣菌落，黏液型銅綠假單胞菌的菌落呈透明膠水樣，鮑曼不動(dòng)桿菌在菌落干燥、聚集處由于色素堆積而呈橙黃色，單個(gè)菌落無(wú)色不透明；陰溝腸桿菌則是天藍色微黃的大菌落。

   該培養基十分適合與快速酶法生化鑒定系統聯(lián)合應用，如此可將G^-b的培養、鑒定縮短至24h左右，大大緩解了臨床用藥與細菌學(xué)診斷之間的矛盾，促進(jìn)了抗生素使用的規范化。且采用該培養基尚可節約一部分生化鑒定試劑，進(jìn)一步促進(jìn)醫療經(jīng)費的節約，縮短病人治療周期，減輕感染病人病痛，具有一定的經(jīng)濟效益和社會(huì )效益。

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