高效脫酚菌的分離篩選

實(shí)驗目的：學(xué)習并掌握分離純化微生物的基本技能和篩選高效脫酚菌的實(shí)驗方法

實(shí)驗材料：

1．培養基

(1)      營(yíng)養肉湯液體培養基。

(2)      營(yíng)養肉湯瓊脂培養基。

(3)      脫酚菌分離培養基：蛋白胨0.5g，磷酸氫二鉀0.1g，硫酸鎂0.05g，蒸餾水 1000mL，調pH7.2~7.4，固體培養基添加1.3%瓊脂粉。

(4)      苯酚標準溶液：稱(chēng)取分析純苯酚1.0g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL，搖勻。此溶液每毫升含苯酚1mg。取此溶液10mL，移入另一100ml容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用K₂CrO₄標準溶液對此溶液的酚濃度進(jìn)行標定。

(5)      四硼酸鈉飽和溶液：稱(chēng)取Na₂B₄O₇ 40g，溶于1L熱蒸餾水中，冷卻后使用，此溶液pH為10.1。

(6)      3% 4-氨基安替比林溶液：稱(chēng)取分析純4-氨基安替比林3g，溶于蒸餾水，并稀釋至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用兩周。

(7)      2％過(guò)硫酸胺溶液：取化學(xué)純過(guò)硫酸胺2g，溶于蒸餾水，并稀釋至100mL，冰箱保存，可用兩周。

2．儀器 恒溫振蕩器、恒溫培養箱、離心機、分光光度計。

3．其它 玻璃珠、錐形瓶、培養皿等

實(shí)驗原理：

環(huán)境中存在著(zhù)各種各樣的微生物，其中某些微生物以有機污染物作為其生長(cháng)所需的能源、碳源或氮源，從而使有機污染物得以降解。在工業(yè)廢水的生物處理中，對污染成分單一的有毒廢水�？蛇x育特定的高效菌種進(jìn)行處理。這些高效菌具有處理效率高、耐受毒性強等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗在以苯酚為唯一碳源的培養基中，經(jīng)富集培養、分離純化、降解試驗等，可篩選出高效脫酚菌。

其中酚濃度的測定采用4-氨基安替比林法。其基本原理：4-氨基安替比林和酚類(lèi)化合物在堿性溶液中和氧化劑鐵氰化鉀作用，生成紅色的安替比林染料，與標準管比色，可測出水樣中酚的含量。生成的色度在水中能穩定約30min，可在波長(cháng)510nm處比色測定。本法最低檢出濃度為0.1mg/L。

實(shí)驗內容：

1．采樣 為了獲得酚分解能力較強的菌種，可在高濃度含酚廢水流經(jīng)的場(chǎng)所采樣。如排放含酚廢水下水道的淤泥．沉渣等，在這些地方分得的微生物往往降解酚能力較強。

2．富集培養 將樣品置于裝有玻璃珠的50mL液體培養基并加有適量苯酚的三角瓶中，30℃震蕩培養。待菌生長(cháng)后，用無(wú)菌移液管吸取1mL轉至另一個(gè)裝有50mL液體培養基并加適量苯酚的三角瓶中。如此連續2~3此，每次所加的苯酚量適當增加，最后可得脫酚菌占絕對優(yōu)勢的混合培養物。

3．平板的分離和純化

（1）用無(wú)菌移液管吸取經(jīng)富集培養的混合菌液0.lmL，注入9.9mL無(wú)菌水中，充分混勻，并繼續稀釋到適當濃度。

（2）取最后三個(gè)稀釋管，分別自各管中吸取稀釋菌液，滴一滴（約0.05mL）于固體平板（倒平板時(shí)添加適量的酚，最終酚濃度為50mg／L左右）中央，每個(gè)稀釋度做2~3個(gè)重復。

（3）用無(wú)菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平，蓋好皿蓋。室溫放置，待接種菌液被培養基吸收后，倒置于30℃恒溫箱，培養1-2 d。

（4）挑選不同形態(tài)的菌落，在含適量酚的固體平板上劃線(xiàn)純化。平板倒置于30℃恒溫箱，培養1～2d。

4．轉接斜面 將純化后的單菌落轉接至補加適量酚的試管斜面，30℃恒溫箱培養24 h 。

5．降解試驗 用接種環(huán)取各斜面菌苔一環(huán)，分別接種于100mL營(yíng)養肉湯液體培養基中，振蕩培養至對數生長(cháng)期（30℃，約16~24h），在培養物中加入少量濃酚液，使培養液內酚濃度達到10mg／L左右，進(jìn)行酚分解酶的誘發(fā)；繼續振蕩培養2h后再次加入濃酚液，使培養液酚濃度提高到50mg／L左右，繼續振蕩培養4h。

6．測定含酚量

(1)      取經(jīng)降解的培養液，10000r/min離心10min后，取上清100μL加入到10mL的試管中，加蒸餾水到5mL，加100uL0.5mol/L的氨水，50uL的2%的4-氨基安替比啉，混均，再加入50uL的8%的鐵氰化鉀溶液，混均，15min后，在510nm處測吸光度。

(2)      計算酚含量，井算出酚的去除率。

酚／(mg·L^-1)=從標準曲線(xiàn)上查得的酚（mg）×1000/V

式中V：取測定樣體積。

細菌脫酚率/%=（培養前酚濃度-培養后酚濃度）/培養前酚濃度*100%-酚揮發(fā)率（%）

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