實(shí)驗前玻璃儀器的預先處理

1、 進(jìn)一步加強學(xué)習、掌握玻璃器具等器材的清洗、烘干、包扎的包扎技術(shù)。

2、為下一次的課做好器材的準備工作。

二、原理

為確保實(shí)驗順利地進(jìn)行，要求把實(shí)驗所用的玻璃器皿清洗干凈。為保持滅菌后和無(wú)菌狀態(tài)，需要對培養皿、吸管等進(jìn)行包扎，對試管和三角瓶等加塞棉塞。這些工作看起來(lái)很普通簡(jiǎn)單，但如操作不當或不安操作規定去做，則會(huì )影響實(shí)驗結果，甚至會(huì )導致試驗的失敗。

滅菌原理：高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。適用于一般培養基、玻璃器皿、無(wú)菌水、金屬用具。一般培養基在121．3℃滅菌20分鐘即可。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當環(huán)境和細胞內含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160—170℃），時(shí)間長(cháng)（1—2小時(shí)）。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì )烤焦，甚至引起燃燒，因而一般塑料制品不能用干熱滅菌。

三、試劑和儀器

（一）儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、試管、三角瓶、培養皿和吸管、棉線(xiàn)、紗布、棉花、牛皮紙、報紙、硅膠塞等

四、實(shí)驗內容

（一） 玻璃器皿的清洗：

        新購的玻璃器皿的洗滌

將器皿放入２％鹽酸溶液中浸泡數小時(shí)，以除去游離的堿性物質(zhì)，最后用流水沖凈。

對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉動(dòng)容器使其內部表面均沾有鹽酸，數分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上晾干，即可使用。

        常用舊玻璃器皿的洗滌

確實(shí)無(wú)病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用前后，可按常規用洗衣粉水進(jìn)行刷洗；

吸取過(guò)化學(xué)試劑的吸管，先浸泡于清水中，待到一定數量后再集中進(jìn)行清洗。

       帶菌玻璃器皿的洗滌

凡實(shí)驗室用過(guò)的菌種以及帶有活菌的各種玻璃器皿，必須經(jīng)過(guò)高溫滅菌或消毒后才能進(jìn)行刷洗：

1、帶菌培養皿、試管、三角瓶等物品，做完實(shí)驗后放入消毒桶內，用0.1MPa滅菌20～30 min后再刷洗。含菌培養皿的滅菌，底蓋要分開(kāi)放入不同的桶中，再進(jìn)行高壓滅菌。

2、帶菌的吸管、滴管，使用后不得放在桌子上，立即分別放入盛有3～5%來(lái)蘇爾或5%石炭酸或0.25%新潔爾滅溶液的玻璃缸（筒）內消毒24h后，再經(jīng)0.1MPa滅菌20 min后，取出沖洗。

3、帶菌載玻片及蓋玻片，使用后不得放在桌子上，立即分別放入盛有3～5%來(lái)蘇爾或5%石炭酸或0.25%新潔爾滅溶液的玻璃缸（筒）內消毒24h后，用夾子取出經(jīng)清水沖干凈。

如用于細菌染色的載玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然后用肥皂水洗，再用清水洗干凈。

        最后將載玻片浸入95%酒精中片刻，取出用軟布擦干，或晾干，保存備用。

若用皂液不能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當時(shí)間后再用清水洗凈。

4、含油脂帶菌器材的清洗

單獨高壓滅菌：用0.1MPa滅菌20～30 min→趁熱倒去污物→倒放在鋪有吸水紙的籃子上→用100 ℃烘烤0.5h→用5%的碳酸氫鈉水煮兩次→再用肥皂水刷洗干凈。

（二）、玻璃器材的晾干或烘干

不急用的玻璃器材：可放在實(shí)驗室中自然晾干；

急用的玻璃器材：把器材放在托盤(pán)中（大件的器材可直接放入烘箱中），再放入烘箱內，用80～120℃烘干，當溫度下降到60℃以下再打開(kāi)取出器材使用。

（三）器皿的包扎：

要滅菌后的器皿仍保持無(wú)菌狀態(tài)，需在滅菌前進(jìn)行包扎。

（1）培養皿：洗凈的培養皿烘干后每10套（或根據需要而定）疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，或裝入特制的鐵桶中，然后進(jìn)行滅菌。

（2） 吸管：洗凈、烘干后的吸管，在吸口的一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時(shí)造成污染。塞入的棉花量要適宜，多余的棉花可用酒精燈火焰燒掉。每支吸管用一條寬約4~5cm的紙條，以30~50℃的角度螺旋形卷起來(lái)，吸管的尖端在頭部，另一端用剩余的紙條打成一結，以防散開(kāi)，標上容量，若干支吸管包扎成一束進(jìn)行滅菌。使用時(shí)，從吸管中間擰斷紙條，抽出試管。

（3）試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞，棉塞可起過(guò)濾作用，避免空氣中的微生物進(jìn)入容器。制作棉塞時(shí)，要求棉花緊貼玻璃壁，沒(méi)有皺紋和縫隙，松緊適宜。過(guò)緊易擠破管口和不易塞入；過(guò)松易掉落和污染。棉塞的長(cháng)度不小于管口直徑的2倍，約2/3塞進(jìn)管口。

目前，國內已開(kāi)始采用塑料試管塞，可根據所用的試管的規格和試驗要求來(lái)選擇和采用合適的塑料試管塞。

若干支試管用繩扎在一起，在棉花部分外包裹油紙或牛皮紙，再用繩扎緊。三角瓶加棉塞后單個(gè)用油紙包扎。

（四）、玻璃器材的滅菌

滅菌:干熱滅菌:160～165℃烘箱中滅菌2h；或濕熱滅菌:121 ℃ 20～30min

        干熱滅菌法

1、將包扎好的玻璃器皿擺入電熱烘箱中，相互間要留有一定的空隙，以便空氣流通。

2、關(guān)緊箱門(mén)，打開(kāi)排氣孔，接上電源。

3、待箱內空氣排出到一定程度時(shí)，關(guān)閉上排氣孔，加熱至滅菌溫度后，固定溫度進(jìn)行滅菌：160℃—165℃保持2小時(shí)。2小時(shí)后切斷電源。

4、待烘箱內溫度自然降溫冷卻到60℃以下后，再開(kāi)門(mén)取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

高壓蒸汽滅菌法

1、關(guān)好排水閥門(mén)，放入純凈水或蒸餾水至標度。注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

2、將須要滅菌的器材、培養基等裝入滅菌鍋中，加蓋密封。旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉到一定程度（不要太緊），然后再旋緊相對的兩個(gè)螺旋，以達到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達不到徹底滅菌的目的。

3、 通電加溫，打開(kāi)排氣活門(mén)，排盡鍋內的空氣。通常當壓力表指針升至5磅或0.05MPa時(shí)，打開(kāi)排氣活門(mén)放氣，待壓力表指針降至零點(diǎn)一小段時(shí)間后，再關(guān)閉活門(mén)。即活門(mén)沖出的全部是蒸汽時(shí)則表示徹底，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門(mén)，如果過(guò)早關(guān)閉活門(mén)，排氣不徹底，也達不到徹底滅菌的目的。

4、恒溫滅菌: 0.1MPa 或15磅壓力保持20～30分鐘。壓力表的指針上升時(shí)，鍋內溫度也逐漸升高，當壓力表指針升至0.1MPa時(shí)或15磅時(shí)，鍋內溫度相當于120℃～121℃（等于一個(gè)大氣壓），此時(shí)開(kāi)始計算滅菌時(shí)間，控制熱源，使處于0.1MPa 或15磅壓力保持20～30分鐘，即能達到完全滅菌的目的，然后停止加溫。當達到所需溫度時(shí)開(kāi)始計時(shí)，并在此溫度下保持所需的時(shí)間。

5、降溫：自然降溫或打開(kāi)活門(mén)排汽降溫。稍微打開(kāi)一點(diǎn)排氣活門(mén)，使鍋內蒸汽緩慢排除，然后逐漸開(kāi)大活門(mén)，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過(guò)快，否則會(huì )使鍋內的培養基沸騰而沖脫或沾染棉花塞，但排氣太慢又使培養基在鍋內，受高溫處理時(shí)間過(guò)長(cháng)，對培養基也是不利的。一般從排氣到打開(kāi)鍋蓋以10分鐘左右為好。

6、當鍋內蒸汽完全排盡時(shí)即壓力表指針降到零時(shí)，要立即打開(kāi)鍋蓋。

7、取出滅菌物品：當鍋內溫度下降到60℃左右時(shí)器材或培養基。如培養基需制備固體斜面培養基時(shí)，則應趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。

8、最后將高壓滅菌器內的剩余水排出。

9、觀(guān)察滅菌效果。把滅菌培養基放入25℃溫箱中，培養48小時(shí)觀(guān)察滅菌效果。 48小時(shí)后不見(jiàn)雜菌生出，便證明培養基已達到滅菌目的，可以使用。

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