環(huán)境中微生物的檢測（2）

1.2水體中的微生物

水體可分為天然水體和人工水體。天然水體包括海洋、江河、湖泊等；人工水體包括水庫、運河、城市排水系統、各種污水處理系統等。水體中含有微生物所需的各種營(yíng)養，因而也是微生物的天然生境。水體中微生物除天然棲息者外，還有來(lái)自土壤、空氣、動(dòng)植物殘體、動(dòng)物排泄物、各類(lèi)工業(yè)廢水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。

1.2.1水中微生物的種類(lèi)、分布

由于各水域中營(yíng)養物質(zhì)的組成、濃度、水溫、溶解氧的差異及微生物的來(lái)源不同，因此其種類(lèi)、數量差異很大。

1.2.1.1 微生物的種類(lèi)

（1）清水型水生微生物

在潔凈的水域中，因營(yíng)養物較少，微生物數量也較少。在每毫升水中一般只含幾十個(gè)到幾百個(gè)細菌，并以自養型種類(lèi)為主。常見(jiàn)的細菌有綠硫細菌、紫色細菌、藍細菌、柄細菌、赫色纖毛菌、球衣細菌和螢光假單胞菌等。此外，還有許多藻類(lèi)（如絲狀綠藻、硅藻等）、真菌（水霉菌屬和綿霉菌屬）、原生動(dòng)物（如鐘蟲(chóng)及其他固著(zhù)型纖毛蟲(chóng)等）和后生動(dòng)物（如枝角類(lèi)、橈足類(lèi)等）。

（2）腐敗型水生微生物

在受到有機物嚴重污染的水域中，數量較多的是細菌，每毫升水中可達幾千萬(wàn)個(gè)甚至幾億個(gè)，以異養菌為優(yōu)勢。異養菌分解有機物，起重要的凈化作用。常見(jiàn)的微生物中，細菌以變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、產(chǎn)氣堿桿菌、等革蘭氏陰性無(wú)芽孢菌為主，此外還有芽孢桿菌、生孢梭菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、弧菌、螺菌、假單胞菌，有的甚至還含有傷寒、痢疾、霍亂等病原體；藻類(lèi)有綠藻、裸藻等；原生動(dòng)物有草履蟲(chóng)、屋滴蟲(chóng)、小口鐘蟲(chóng)等。

1.2.1.2 微生物的分布

影響微生物在水體中分布的因素有：水體類(lèi)型、污染程度、有機物的含量、溶解氧量、水溫、pH及水深等。

微生物在水體中的水平分布規律為：近岸水域中細菌數量較多，離岸越遠的地方，微生物越少；底泥中的細菌多于水中的細菌。

微生物在較深較大的靜水水域中的垂直分布規律是：在上層水體中（水面下0~10m深處），氧含量較高，主要有好氧細菌（如假單脆菌、柄桿菌、球衣細菌等）、真菌和藻類(lèi)；中層水體（水深20~30m）主要有光合細菌（如紅硫細菌和綠硫細菌）以及厭氧細菌；底層水體中（30m以下及湖底泥），主要有脫硫弧菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷球菌屬等厭氧細菌。微生物的數量以5~10m深處為最多，隨著(zhù)深度的增加而減少。

地下水由于經(jīng)過(guò)土壤過(guò)濾、有機物缺乏，故含菌量遠遠少于地面水，在深層地下水中甚至沒(méi)有細菌。

1.2.2 水的細菌學(xué)檢測

1.2.2.1 細菌總數（CFU）的測定

細菌總數是將定量水樣（原水樣或作一定稀釋后水樣1mL）接種在普通營(yíng)養瓊脂培養基內，于37℃培養24h后觀(guān)察結果，計數其上長(cháng)出的細菌菌落數，然后換算求出原水樣每mL中所含的細菌數。

其測定步驟和土壤中微生物的分離計數方法基本相同，但須注意：①水樣是用無(wú)菌采樣瓶直接采取水樣；②水樣接種于營(yíng)養瓊脂培養基中，在37℃下培養24h；

在37℃營(yíng)養瓊脂培養基中能生長(cháng)的細菌，代表在人體溫度下能繁殖的異養型細菌。細菌總數越多，說(shuō)明水被有機物或糞便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。

在生活飲用水中所測得的細菌總數，除說(shuō)明水被生活廢棄物污染的程度外，還可指示該水能否飲用�？稍谏�活飲用水進(jìn)行衛生學(xué)評價(jià)時(shí)提供依據。

我國生活飲用水標準（GB5749-85）規定，細菌總數不得超過(guò)100個(gè)/ml。

一般認為在天然水體中，如10～100個(gè)/mL，為極清潔的水；100～1000個(gè)/mL，為清潔的水；1000～10000個(gè)/mL，為不太清潔的水；10000～100000個(gè)/mL，為不清潔的水；大于100000個(gè)/mL，為極不清潔的水。

1.2.2.2 大腸菌群的測定

天然水體的細菌性污染主要源于生活污水中的糞便，即水中的病原菌很可能是腸道傳染病的病原。通常情況下，水中病原菌的含量極少，而細菌種類(lèi)卻很多，需要耗費大量的人力、物力及復雜的分離培養技術(shù)，才能將病原菌一一檢測出來(lái)。最常見(jiàn)的數量極大的大腸菌群與病原菌同樣來(lái)自于動(dòng)物糞便，根據這一點(diǎn)，只要通過(guò)檢查水樣中的指示菌――大腸菌群，即可知道該水體被糞便污染的程度，從而間接推測其他病原菌存在的概率。

大腸菌群是指那些能在37℃下，24~48h之內使乳糖發(fā)酵并產(chǎn)酸產(chǎn)氣、好氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。主要包括大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣桿菌、枸櫞酸鹽桿菌、副大腸桿菌。

大腸埃希氏菌即大腸桿菌是人和溫血動(dòng)物腸道中的正常細菌，兼性好氧的革蘭氏陰性、無(wú)芽孢、兩頭鈍圓的桿菌，大小0.5~0.8mm×2.0~3.0mm；最適溫度37℃，最適的pH為中性；能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多種碳水化合物，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸菌群的各類(lèi)細菌的生理習性都相似，只是副大腸桿菌不分解或緩慢分解乳糖。在遠滕氏培養基（品紅亞硫酸鈉培養基）或伊紅美藍培養基表面會(huì )形成具有特殊現象的菌落，大腸埃希氏桿菌的菌落呈紫紅色帶金屬光澤；枸櫞酸鹽桿菌的菌落呈紫紅或深紅色；產(chǎn)氣桿菌的菌落呈淡紅色，中心色深；副大腸桿菌的菌落則無(wú)色透明。這些現象可作為鑒別的依據。

大腸菌群的檢驗方法有發(fā)酵法和濾膜法。發(fā)酵法是測定大腸菌群的基本方法，包括初發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個(gè)部分。

（1）初發(fā)酵試驗

發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養基，并倒置一小倒管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀(guān)察細菌的產(chǎn)酸情況，培養基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑。細菌產(chǎn)酸后，培養基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還能抑制其他細菌如有芽胞的細菌生長(cháng)。

水樣接種于發(fā)酵管內，37℃下培養，24h內小倒管中有氣體形成，并且培養基混濁，顏色黃，說(shuō)明水中存在大腸菌群，為陽(yáng)性結果。對于只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的，不能說(shuō)明是陰性結果，因為在菌量少的情況下，可能延遲至48h后才產(chǎn)氣，此時(shí)應視為可疑結果。需繼續做下面兩部分實(shí)驗，才能確定是否是大腸菌群。既不產(chǎn)酸又不產(chǎn)氣的，為陰性結果。

（2）平板分離

平板培養基一般使用遠藤氏培養基或伊紅美藍瓊脂培養基，前者含有堿性品紅染料，在此作為指示劑，它可被培養基中的亞硫酸鈉脫色，使培養基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛立即與品紅反應，形成深紅色復合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長(cháng)。伊紅美藍瓊脂培養基則含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠藤氏培養基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色菌落。

將培養24h后產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管，分別劃線(xiàn)接種在平板上。經(jīng)過(guò)37℃培養24h，挑取典型的大腸菌群菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡驗后若呈陰性，則可認為有此類(lèi)細菌存在。為了更進(jìn)一步驗證，可做下一步實(shí)驗。

（3）復發(fā)酵實(shí)驗

將染色為革蘭氏陰性、無(wú)芽胞桿菌的菌落再移植于乳糖培養基中，原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)24h培養產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結果。

根據發(fā)酵陽(yáng)性管的數量，以確定大腸菌群數。

除查表外，也可以用計算法求出大腸菌群數。即根據初發(fā)酵的發(fā)酵管數、大腸菌群陽(yáng)性管數及檢測水樣量，利用數理統計原理，計算出每升水樣中大腸菌群的最近似數（MPN）。

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