羊梭菌病多聯(lián)滅活疫苗生產(chǎn)用厭氧培養基的研究

1  新疆畜牧科學(xué)院獸醫研究所，新疆烏魯木齊  830000

2  新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生物制品事業(yè)部，新疆烏魯木齊  830013

 

關(guān)鍵詞：厭氧菌培養基；肉肝胃酶消化湯；產(chǎn)氣莢膜梭菌（B型、D型）；腐敗梭菌；培養試驗；毒素

 

     梭菌性疾病是由厭氣梭菌屬中多種梭菌引起的一類(lèi)各種動(dòng)物的傳染病，如快疫、猝狙、痢疾、腸毒血癥、氣腫疽、黑疫、肉毒梭菌中毒癥、破傷風(fēng)等。這類(lèi)疾病以發(fā)病急速、病程短促來(lái)不及治療而病死率高為特征。病原菌多為土壤性細菌，廣泛存在于世界各地，造成很大的經(jīng)濟損失。梭菌性疾病的免疫，主要是通過(guò)滅活梭菌培養過(guò)程中所產(chǎn)的毒素而實(shí)現，毒素為疫苗的主要有效免疫抗原。因此，培養這類(lèi)細菌，使它們大量生長(cháng)繁殖并且分泌高效價(jià)的毒素、表達強毒力可以制作出免疫效果優(yōu)良的疫苗。羊快疫（腐敗梭菌）、羔羊痢疾（產(chǎn)氣莢膜梭菌B型）、腸毒血癥（產(chǎn)氣莢膜梭菌D型）三聯(lián)滅活疫苗就是其中一種，它可以預防羊的快疫、猝狙（產(chǎn)氣莢膜梭菌C型）、羔羊痢疾和腸毒血癥四種傳染病，故稱(chēng)為羊梭菌病三聯(lián)四防苗（簡(jiǎn)稱(chēng)羊三聯(lián)四防苗），這種疫苗在我國廣泛使用。

目前厭氣梭菌的培養，多使用厭氣肉肝胃酶消化湯，需要牛肉、肝、胃蛋白酶等昂貴的原料，成本高昂，工藝復雜。另一方面，受到肉品質(zhì)的影響（如抗生素的殘留、新鮮度等），使得培養基品質(zhì)不穩定、質(zhì)量不宜控制，進(jìn)而影響到疫苗的品質(zhì)。

本試驗旨在研制一種適合于厭氧菌生長(cháng)繁殖并良好產(chǎn)毒的培養基，可應用于厭氧菌引起的疫苗制造、疾病診斷等研究領(lǐng)域。替代目前常用的、成本昂貴且需要復雜處理工序的動(dòng)物源性材料的培養基。

1  材料和方法

1.1  主要試劑

蛋白胨分別為上海上食肉類(lèi)有限公司生產(chǎn)的海豚牌蛋白胨（25kg袋裝,骨粉為原料制備）、上海東海制藥廠(chǎng)生產(chǎn)的生化試劑蛋白胨(500g瓶裝,魚(yú)類(lèi)蛋白質(zhì)水解物) 和細菌學(xué)F403蛋白胨(250g瓶裝，藥用帶魚(yú)粉為基質(zhì)酶水解而成)；酵母浸出粉，上海冠生園添加劑制品有限公司生產(chǎn)；麥芽糊精，甘肅張掖龍源食品有限責任公司生產(chǎn)。

1.2  菌種

產(chǎn)氣莢膜梭菌B型（C58—2）、D型（C60—2），腐敗梭菌（C55—1）由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3  培養基

自行設計，厭氧菌基礎培養基Ⅰ含蛋白胨、酵母浸出粉、糊精、葡萄糖、亞硫酸鈉、硫代乙醇酸鈉、無(wú)機鹽等,用NaOH調pH至8.0～8.5，116℃30min高壓滅菌即可；厭氧菌基礎培養基Ⅰ添加M等生長(cháng)因子組成厭氧菌基礎培養基Ⅱ。肉肝胃酶消化湯培養基，按《中華人民共和國獸用生物制品規程》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《規程》）介紹的方法配制^[1]。

1.4  實(shí)驗動(dòng)物

昆明（KM）小鼠，16—20g，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生物制品事業(yè)部動(dòng)物室自繁自養；新西蘭白兔，1.5—2.0kg，購于新疆地方病研究所動(dòng)物中心。

1.5  試驗方法

1.5.1 細菌的培養  按《規程》方法將細菌接種于各種不同的試驗培養基中培養，經(jīng)對比試驗優(yōu)化培養基營(yíng)養組分。

1.5.2  毒素或毒力測定  按《規程》方法進(jìn)行。

1.5.3  疫苗配制與成品檢驗  按《規程》進(jìn)行�？煲卟捎霉ザ痉ㄐ�檢，猝狙、痢疾、腸毒血癥采用免疫血清中和毒素法效檢。

2  結  果

2.1 設計的厭氧菌基礎培養基Ⅰ中，Zn²⁺、Mg²⁺離子對細菌生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（使用細菌學(xué)F403蛋白胨，含L-半胱氨酸鹽酸鹽），通過(guò)添加MgSO₄和ZnSO₄的比較試驗結果說(shuō)明，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型，在含Mg²⁺培養基中比含Zn²⁺培養基中的毒力略高。產(chǎn)氣莢膜梭菌D型在含Mg²⁺和含Zn²⁺培養基中其產(chǎn)生毒素的能力相同。腐敗梭菌在含Zn²⁺培養基中的毒力比含Mg²⁺培養基中的毒力要高，含Mg²⁺培養基沒(méi)有沒(méi)有達到《規程》規定的最小致死量標準。

表1  厭氧菌基礎培養基I中添加Zn²⁺、Mg²⁺離子對細菌產(chǎn)毒的影響

 

注：①攻毒劑量單位為ml;②表中分數表示注射后24h內的小鼠死亡數/注射數。以下同。

2.2  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中L-半胱氨酸鹽酸鹽對細菌生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（使用細菌學(xué)F403蛋白胨、含Zn²⁺離子），通過(guò)L-半胱氨酸鹽酸鹽添加與否的比較試驗，觀(guān)察其對細菌產(chǎn)毒的影響，見(jiàn)表2.試驗結果說(shuō)明，在培養基中L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對各細菌產(chǎn)毒促進(jìn)作用不明顯，兩組測毒結果相同。

表2 厭氧菌基礎培養基 I中添加 L一半胱氨酸鹽酸鹽對細菌產(chǎn)毒的影響

 

2.3  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中不同品質(zhì)蛋白胨對細菌生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（含Zn²⁺離子），通過(guò)使用不同品質(zhì)的蛋白胨培養細菌后的產(chǎn)毒結果，見(jiàn)表3 ，可見(jiàn)使用生化試劑蛋白胨和細菌學(xué)F403蛋白胨培養基培養的各細菌產(chǎn)生的毒力相差不大，均可達到規程規定的相應標準，但與肉肝胃酶消化湯相比，略顯差異。使用海豚牌袋裝骨粉蛋白胨培養的細菌產(chǎn)生毒力較差，除產(chǎn)氣莢膜梭菌D型外，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和腐敗梭菌均未達到《規程》規定的毒力標準。

表3 厭氧菌基礎培養基 I中使用不同品質(zhì)蛋白胨對細菌產(chǎn)毒的影響

 

 

2.4  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中葡萄糖的添加量對細菌生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（含Zn²⁺離子，蛋白胨為生化試劑蛋白胨）葡萄糖的添加量對產(chǎn)氣莢膜梭菌D型、B型和腐敗梭菌的產(chǎn)毒影響不大，在添加0.2—1%范圍內，培養的細菌均能良好產(chǎn)毒，達到《規程》規定的毒力標準。結果見(jiàn)表4

表4 厭氧菌基礎培養基 I中葡萄糖的添加量對細菌產(chǎn)毒的影響

 

 

2.5  厭氧菌基礎培養基中添加生長(cháng)刺激因子M等（厭氧菌基礎培養基Ⅱ）對細菌生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ（含Zn²⁺離子，蛋白胨為袋裝海豚牌骨粉蛋白胨）中添加一種生長(cháng)刺激因子M組成的培養基，我們稱(chēng)其為厭氧菌基礎培養基Ⅱ。用此培養基無(wú)論是培養產(chǎn)氣莢膜梭菌D型、B型還是培養腐敗梭菌，它們產(chǎn)生的毒素或毒力，均達到《規程》規定的最高毒力標準。結果詳見(jiàn)表5。

表 5 厭氧菌基礎培養基 Ⅱ中細菌產(chǎn)毒結果

 

 

2.6 厭氧菌基礎培養基Ⅱ中糊精對產(chǎn)氣莢膜梭菌B型生長(cháng)和產(chǎn)毒的影響

在厭氧菌基礎培養基Ⅱ中，糊精可以起到提高產(chǎn)氣莢膜梭菌B型產(chǎn)毒素的能力。在有糊精的情況下，無(wú)論是含葡萄糖0.3%還是0.5%的培養基，攻擊毒素劑量0.001ml，均2/2致死KM小鼠；無(wú)糊精的培養基，無(wú)論葡萄糖0.3%還是0.5%，攻擊毒素劑量0.001ml，只1/2致死KM小鼠，低于前者水平。攻擊毒素劑量0.002ml時(shí)，培養基無(wú)論含與不含糊精，各組均2/2致死KM小鼠。見(jiàn)表6。

表 6 厭氧菌基礎培養基 Ⅱ中糊精對產(chǎn)氣莢膜梭菌 B型產(chǎn)毒的影響

 

2.7  厭氧菌基礎培養基培養細菌菌液配制的羊三聯(lián)四防苗檢驗結果

使用研制的厭氧菌基礎培養基培養的毒力達到《規程》規定的細菌菌液按配制3批疫苗，并進(jìn)行檢驗，3批疫苗的無(wú)檢、安檢和效檢均達到《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》^[2]的規定。見(jiàn)表7

表7 厭氧菌基礎培養基 I和培養基 Ⅱ培養細菌菌液配制的三聯(lián)四防苗檢驗結果

注： 血清中和試驗動(dòng)物為K M小鼠， 攻毒試驗動(dòng)物為家兔， 對照均2／2死亡； 腐敗梭菌 1 MLD為0.6 m L 。

3  討  論

由于厭氧菌自身缺乏有氧代謝必備的各種酶，如細胞色素和細胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶以及超氧化物歧化酶，造成自身代謝的缺陷，無(wú)法進(jìn)行有氧代謝，而無(wú)氧酵解所產(chǎn)生的能量不足，所以厭氧菌在正常大氣環(huán)境下即不能生長(cháng)又不能存活，要求的生長(cháng)條件比較特殊。為使厭氧菌能正常生長(cháng)，必須制備營(yíng)養成分豐富，氧化還原電勢較低，具有特殊生長(cháng)因子的專(zhuān)用培養基。通常用心、腦或其它臟器浸液配制厭氧菌培養基，并加入硫乙醇酸鈉、美藍、刃天青、氨基酸、葡萄糖、肝塊、肉渣、還原鐵、脫脂棉或少量活性炭等還原劑和除氧材料^[3]�！兑幊獭分杏糜趨捬蹙�培養生產(chǎn)疫苗的培養基主要有厭氣肉肝湯、多蛋白胨牛心湯培養基、厭氣肉肝胃酶消化湯、魚(yú)肉胃酶消化湯肉肝湯、肉渣培養基等，培養基類(lèi)型復雜，制造工藝煩瑣，成本高。

厭氧梭菌的類(lèi)毒素具有很好的免疫原性，其疫苗的質(zhì)量除與細菌本身的產(chǎn)毒能力（遺傳特性）有關(guān)外，還與培養方法和厭氧產(chǎn)毒培養基密切相關(guān)^[4]。產(chǎn)毒素強的培養基，制造出的疫苗效力就好，因此，我們可以用培養基產(chǎn)生毒素（毒力）的強弱作為選擇培養基的標準之一。

我們設計的厭氧菌基礎培養基分為三個(gè)系統，即厭氧系統（提供較低的氧化還原電勢）、營(yíng)養系統（提供促進(jìn)生長(cháng)代謝的基礎物質(zhì)，碳原、氮源、生長(cháng)因子等）和輔助系統（即維持良好的厭氧環(huán)境，又提供營(yíng)養成分）。厭氧系統采用添加還原劑亞硫酸鈉、硫乙醇酸鹽、葡萄糖（厭氧與營(yíng)養雙重作用）等，使培養基保持較低的氧化還原電勢，以保證厭氧菌生長(cháng)的良好環(huán)境；營(yíng)養系統采用添加蛋白胨、酵母浸出粉和礦物質(zhì)等，使培養基含有較豐富的胨、肽、氨基酸、維生素等營(yíng)養成分，利于細菌生長(cháng)繁殖和產(chǎn)毒；輔助系統采用添加糊精起到增加培養基的粘稠度，減少液體培養基中氧的溶解并可作為葡萄糖被利用后的后續碳源而被吸收利用的作用。所選原材料，均為成本較低的市售生物和化學(xué)試劑。經(jīng)對產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、D型和腐敗梭菌的培養試驗證明，產(chǎn)氣莢膜梭菌D型無(wú)論在培養基Ⅰ還是Ⅱ中，所有培養物所產(chǎn)毒素結果均達到規程規定的0.0005 ml致死KM小鼠的高標準，在疫苗的生產(chǎn)中采用廉價(jià)的厭氧菌基礎培養基Ⅰ，完全可以達到厭氣肉肝胃酶消化湯的培養標準，而原料成本僅為其21%。在篩選優(yōu)化成分的厭氧菌基礎培養基Ⅰ中添加一種生長(cháng)刺激因子（M）成為厭氧菌基礎培養基Ⅱ，對產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和腐敗梭菌的培養效果也達到了《規程》規定的最高產(chǎn)毒標準，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型毒素0.001 ml和腐敗梭菌菌液0.01 ml致死KM小鼠，原料成本也僅為厭氣肉肝胃酶消化湯的27%。

試驗中還發(fā)現，在我們設計的培養基中，Zn²⁺對腐敗梭菌的毒力表達具有促進(jìn)作用，而Mg²⁺似乎對產(chǎn)氣莢膜梭菌B型的產(chǎn)毒效果較佳。厭氧菌培養中通常添加的可促進(jìn)細菌生長(cháng)繁殖的生長(cháng)刺激因子L-半胱氨酸鹽酸鹽在我們的試驗中對細菌產(chǎn)毒沒(méi)有明顯效果。葡萄糖的添加量在0.2-1%范圍內對細菌產(chǎn)毒的增加影響不大。培養基中糊精的添加，對細菌的產(chǎn)毒有利。在厭氧菌基礎培養基Ⅱ中均使用袋裝骨粉蛋白胨，效果與生化試劑蛋白胨和細菌學(xué)F403蛋白胨相同，然而，價(jià)格卻相當于它們的1/20，在羊三聯(lián)四防苗的大生產(chǎn)中，降低成本產(chǎn)生的經(jīng)濟效益十分顯著(zhù)。

另外，我們還進(jìn)行了培養基中活性炭的添加試驗，結果證明對促進(jìn)產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、D型和腐敗梭菌的生長(cháng)繁殖和產(chǎn)毒沒(méi)有明顯效果。

實(shí)驗試制的三批疫苗經(jīng)檢驗，均達到《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》的標準，目前已在大生產(chǎn)中廣泛使用，效果進(jìn)一步得到驗證。說(shuō)明我們研制的厭氧菌培養基培養的產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌所產(chǎn)毒素等抗原成分的免疫原性良好。

試驗證明，我們研制的厭氧菌基礎培養基Ⅱ可以作為產(chǎn)氣莢膜梭菌B、D型和腐敗梭菌通用的優(yōu)良產(chǎn)毒培養基，成本僅略高于厭氧菌基礎培養基Ⅰ；對于產(chǎn)氣莢膜梭菌D型的培養，厭氧菌基礎培養基Ⅰ和厭氧菌基礎培養基Ⅱ沒(méi)有明顯差別，生產(chǎn)中完全可以使用厭氧菌基礎培養基Ⅰ。上述培養基成本低廉，產(chǎn)毒效果穩定，配制方法簡(jiǎn)單（省去購肉、冷庫保存、剔選、絞碎、保溫消化、提清過(guò)濾等工序，市售生物化學(xué)試劑依次添加溶解即可），質(zhì)量穩定可靠，還可節省人工，縮短生產(chǎn)周期。它們不僅可以應用于厭氧菌疫苗的生產(chǎn)，對于厭氧菌病的疾病診斷和研究都有重要的實(shí)際意義。

參考文獻

〔1〕 中華人民共和國農業(yè)部. 中華人民共和國獸用生物制品規程二OOO年版[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社.48-51.

〔2〕 中華人民共和國農業(yè)部. 中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準二OO一年版[S]. 北京：中國農業(yè)科技出版社.33-34．

〔3〕 微生物培養基的制造與應用[M]。陳天壽主編，中國農業(yè)出版社. 5-6.

〔4〕 T Shimizu, A Okabe, J Mingani, et al. An upstream regulatory sequence stimulates expression of the perfingosin O gene of Clostridium perfringens[Ｊ]．Infection and immunity. 1991,59:137～142．

〔5〕 蔣玉文,王泰健,屠偉英，等. 羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、腸毒血癥滅活疫苗復合培養基的研究[J].  中國獸藥雜志，1994年（第28卷）第1期，3-8。

作者簡(jiǎn)介  黃炯，男，1963年生，新疆畜牧科學(xué)院獸醫研究所傳染病室副主任，副研究員，從事預防獸醫學(xué)和生物制品學(xué)研究。郵編830000，電話(huà)4844134，傳真4844630，E-mail：huangjQxj.cninfo.net