一、 方法概要
本方法系以0.45 μm孔徑之濾膜過(guò)濾水樣，檢測水中大腸桿菌(Escherichia coli)。水樣過(guò)濾后置于mTEC培養基(modified membrane-Thermotolerant Escherichia coli Agar，縮寫(xiě)為modified mTEC Agar)上，于35±1℃培養2小時(shí)，再以44.5±0.5℃培養22~24小時(shí)，大腸桿菌會(huì )形成紅色或紫紅色菌落。
方法原理是培養基內含之色原(5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸，5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)被大腸桿菌之尿甘酸化酶(β-D-glucuronidase)催化而產(chǎn)生紅色或紫紅色菌落。
二、 適用范圍
本方法適用于飲用水水質(zhì)、飲用水水源水質(zhì)、地面水體、地下水體、廢水、污水、及海水等水樣中大腸桿菌之檢驗。但不適于高濁度及含有干擾物質(zhì)水樣之檢測。
三、 干擾
（一） 水樣中含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌生長(cháng)之物質(zhì)時(shí)，會(huì )影響水樣之檢測結果。
（二） 檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌生長(cháng)之物質(zhì)時(shí)，會(huì )影響水樣之檢測結果。
（三） 懸浮微粒過(guò)高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落彌漫生長(cháng)(Spreading)而影響水樣檢驗結果之判讀。
四、 設備
（一） 量筒：一般使用100~1000 mL之量筒。
（二） 吸管：一般使用1~10 mL之滅菌玻璃吸管或無(wú)菌塑料吸管，應有0.1 mL之刻度。
（三） 稀釋瓶： 100~1000 mL能耐高壓滅菌之有蓋硼硅玻璃制品。
（四） 三角錐瓶：250~2000 mL能耐高壓滅菌之硼硅玻璃制品。
（五） 采樣容器：無(wú)菌之玻璃或塑料制有蓋容器，使用市售無(wú)菌袋亦可。
（六） 培養皿：硼硅玻璃或可拋棄式塑料制培養皿�？墒褂�60×15 mm、50×12 mm或其它適當大小者。
（七） 過(guò)濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑料、陶瓷或不銹鋼等材質(zhì)構成之無(wú)縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定于底座。
（八） 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。
（九） 濾膜：使用直徑47 mm、孔徑0.45 µm且有格子記號的無(wú)菌濾膜，能使水中大腸桿菌完全滯留者。
（十） 鑷子：前端圓滑內側無(wú)波紋。
（十一）水浴槽：溫度能維持在50℃左右者。如用于44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。
（十二）培養箱：溫度能維持在35±1℃者。如用于44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。
（十三） 加熱板：附磁石攪拌功能者。
（十四） 天平：能精稱(chēng)至0.01 g者。
（十五） 高壓滅菌釜：能以中心溫度121℃（壓力約15 lb/in2或1.1 kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。
（十六） 烘箱:用于玻璃器皿等用具之干熱滅菌，溫度能維持在160℃達2小時(shí)或170℃達1小時(shí)以上者。
五、 試劑及材料
本方法所使用的化學(xué)藥品均為試藥級，培養基為微生物級制品。
（一） 培養基
mTEC培養基(modified mTEC Agar）成份：
3號蛋白胨(Protease Peptone ＃3) 5.0 g
酵母抽出物(Yeast Extract) 3.0 g
乳糖(Lactose) 10.0 g
氯化鈉(Sodium Chloride) 7.5 g
磷酸氫二鉀(Dipotassium Phosphate) 3.3 g
磷酸二氫鉀(Monopotassium Phosphate) 1.0 g
硫酸月桂酸鈉(Sodium Lauryl Sulfate) 0.2 g
脫氧膽酸鈉(Sodium Desoxycholate) 0.1 g
5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸(5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) 0.5 g
瓊脂(Agar) 15.0 g
使用市售商品化培養基45.6 g，加入1公升的蒸餾水，煮沸溶解后以121℃高溫高壓滅菌15分鐘，培養基最終pH值應為7.3±0.2。取出后置于45~50℃之水浴槽待溫度下降至恒溫，培養基混搖均勻后分裝于培養皿中，厚度約3~5 mm。凝固后避光保存于冰箱中備用，分裝后之培養基保存期限為14天�？梢罊z測需要量按比例適量配制。
（二） 無(wú)菌稀釋液
無(wú)菌稀釋液一：非海水水樣檢測稀釋用。配制方法如下：
磷酸二氫鉀儲備溶液
取3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于50 mL的蒸餾水中，待完全溶解后，以1.0 M NaOH溶液調整其pH值為7.20±0.05，然后加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過(guò)濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)后，儲存于冰箱中作為儲存液備用。
氯化鎂儲備溶液
取8.1 g氯化鎂（MgCl2‧6H2O）先溶于少量蒸餾水，待完全溶解后，再加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過(guò)濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)后，保存于冰箱中作為儲存液備用。
無(wú)菌稀釋液
分別取10 mL氯化鎂儲備溶液和2.5 mL磷酸二氫鉀溶液，加入蒸餾水至全量為2000 mL，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng)121℃高溫高壓滅菌15分鐘，作為無(wú)菌稀釋液備用。
無(wú)菌稀釋液二：海水或含鹽水樣稀釋用。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 0.58 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.50 g
氯化鈉(NaCl) 8.50 g
將上述成分溶解于1公升的蒸餾水中，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng)121℃滅菌15分鐘，其滅菌后之pH值為7.4 ±0.2。
六、 采樣與保存
（一） 采取微生物檢測之水樣時(shí)，應使用清潔并經(jīng)滅菌之玻璃或塑料容器或市售無(wú)菌采樣袋。且于采樣時(shí)應避免受到污染。水樣若含有余氯時(shí)，無(wú)菌容器中應加入適量無(wú)菌之硫代硫酸鈉（120 mL的水樣中加入0.1 mL、10﹪的硫代硫酸鈉可還原15 mg/L的余氯）。
（二） 水樣運送及保存之溫度應維持在0~5℃并于采樣24小時(shí)內完成檢測。
（三） 水樣量以能做完所需檢測為度，但不得少于200 mL。
七、 步驟
（一） 水樣在進(jìn)行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃25次以上，以使樣品充分混合均勻。
（二） 水樣稀釋?zhuān)?/DIV>
飲用水水樣不需稀釋。
其它樣品則視水樣中大腸桿菌可能濃度范圍進(jìn)行水樣稀釋。
使用無(wú)菌吸管吸取10 mL之水樣至90 mL之無(wú)菌稀釋液中，形成10倍稀釋度之水樣，混搖均勻。而后自10倍稀釋度水樣以相同操作方式進(jìn)行一系列之100、1000倍等稀釋水樣，并混搖均勻。進(jìn)行上述稀釋步驟時(shí)，均需更換無(wú)菌吸管。
（三） 以無(wú)菌鑷子夾起無(wú)菌濾膜，放在無(wú)菌過(guò)濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定。將過(guò)濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無(wú)菌稀釋液，以測定過(guò)濾設備是否裝置妥當。
（四） 檢驗飲用水水樣時(shí)，直接過(guò)濾100 mL的水樣。其它水樣視大腸桿菌可能濃度范圍，以無(wú)菌吸管吸取10 mL的原液及（或）各稀釋度水樣至無(wú)菌過(guò)濾器中過(guò)濾。過(guò)濾后，再以20至30 mL之無(wú)菌稀釋液沖洗漏斗。每個(gè)稀釋度水樣均需進(jìn)行兩重復。
（五） 沖洗過(guò)濾后，解開(kāi)真空裝置，將漏斗移開(kāi)，盡速以無(wú)菌鑷子取出過(guò)濾后之濾膜置于培養基上。濾膜應與培基完全貼合，避免產(chǎn)生氣泡。培養皿倒置于35±1℃的恒溫培養箱中培養2小時(shí)，然后再于44.5±0.5℃的培養箱或水浴槽中培養22~24小時(shí)。如放置于水浴槽中培養，應將培養皿倒置密封于防滲水塑料袋內(如采樣袋)，塑料袋須完全浸入水中。如使用松蓋培養皿放置于培養箱中培養，應將培養皿放置于密閉容器中，且容器內側底部應放置濕紙巾或濕布，以避免培養基之水份喪失而影響細菌生長(cháng)。
（六） 過(guò)濾不同稀釋度水樣時(shí)，應更換無(wú)菌過(guò)濾器（漏斗）。亦可將過(guò)濾器（漏斗）以火烤后約降至室溫重復使用。
（七） 計算并記錄各稀釋度培養皿中所產(chǎn)生的紅色或紫紅色菌落。若菌落過(guò)多造成判讀困難，則以「大腸桿菌菌落太多無(wú)法計數」（E. coli Too numerous to count ; TNTC）表示。
八、 結果處理
（一） 選取大腸桿菌菌落數介于20至80間之同一稀釋度的兩個(gè)培養皿，計算其每100 mL水樣之大腸桿菌菌落數，單位為CFU/100mL。計算公式如下：
大腸桿菌菌落數=所選取培養皿之紅色或紫紅色菌落數×100(CFU/100mL) 所選取培養皿之實(shí)際水樣體積總合
（二） 培養皿之大腸桿菌菌落數不在20至80個(gè)菌落之間時(shí)，則以下列方式處理：
若原液及各稀釋度水樣中僅有一個(gè)稀釋度的一個(gè)培養皿菌落數在20至80 個(gè)之間，則選取該稀釋度的兩個(gè)培養皿以上述公式計算之。
若僅原液有大腸桿菌菌落產(chǎn)生，且少于20個(gè)，應循上述公式計數菌落數；若過(guò)濾100 mL原液，培養皿中均無(wú)菌落生長(cháng)，則結果以「<1 CFU/100mL」表示；若過(guò)濾10 mL原液，培養皿中均無(wú)菌落生長(cháng)，則結果以「<10 CFU/100mL」表示。
若各培養皿之大腸桿菌菌落數均不在20至80個(gè)之間，則選取大腸桿菌菌落數最接近80之同一稀釋度的兩個(gè)培養皿以上述公式計算。但不可選用菌落總數大于200之培養皿。
（三） 數據表示：菌落數小于100時(shí)，以整數表示（小數字四舍五入），菌落數大于100 以上時(shí)，取兩位有效數字，并以科學(xué)記號表示，例如菌落數為112時(shí)以1.1×102 表示之，菌落數為117時(shí)以1.2×102 表示之，菌落數為65000時(shí)以6.5×104 表示。
（四） 檢測紀錄必須注明采樣時(shí)間、開(kāi)始培養時(shí)間、結束培養時(shí)間、培養基名稱(chēng)及各稀釋度的原始數據。
九、 質(zhì)量管理
（一） 微生物采樣及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
（二） 進(jìn)行微生物檢測時(shí)，所用的盛裝器具均應經(jīng)滅菌處理。
（三） 每次采樣時(shí)，應進(jìn)行一組運送空白及野外空白。
（四） 每批次或每10個(gè)水樣須進(jìn)行一次試劑空白。
（五） 新購之mTEC培養基，每批次均須以已知的大腸桿菌及非大腸桿菌(例如Bacillus subtilis)之菌株作測試，以確保數據質(zhì)量。
（六） 若連續一個(gè)月水樣均未檢出大腸桿菌，則須以大腸桿菌菌株進(jìn)行培養基測試，以確保數據質(zhì)量。
（七） 應記錄所有稀釋度水樣的原始數據，以備查核之用。
（八） 每個(gè)稀釋度水樣至少須進(jìn)行二重復。
（九） 本方法培養所得之細菌可能具有感染性，檢測后之培養基及器皿應經(jīng)高溫高壓滅菌處理。
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