幾種培養基選擇性分離稀有放線(xiàn)菌的方法

放線(xiàn)菌作為新的生物活性代謝產(chǎn)物的主要來(lái)源早已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。自從鏈霉菌素的發(fā)現 ， 大量抗生素從Streptomyces 和Streptovertieilliura分離得到， 例如氯霉素、氨基苷類(lèi)、 四環(huán)素、 大環(huán)內酯類(lèi)和頭孢霉素等…。因此，放線(xiàn)菌被認為是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟及研究?jì)r(jià)值的微生物。長(cháng)期的研究重點(diǎn)集中在土壤中的優(yōu)勢菌鏈霉菌上。對這一類(lèi)群菌的廣泛篩選， 的確發(fā)現了很多新種，而且它們能產(chǎn)生多種有用次生代謝產(chǎn)物 。然而，隨著(zhù)大量生物活性物質(zhì)的不斷發(fā)現，從鏈霉菌得到新的生物活性物質(zhì)的幾率逐漸下降。同時(shí)，另一類(lèi)菌——稀有放線(xiàn)菌逐漸引起了新藥開(kāi)發(fā)研究者們的注意。

本文主要從分離培養基的設計角度，介紹了幾種主要的且能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的稀有放線(xiàn)菌高選擇性分離方法。根據目的菌對各種條件的耐受范圍和有利于它們生長(cháng)的條件，選擇和設計培養基的成分、 酸堿度等。 

葡萄糖—天門(mén)冬酰胺改良培養基、淀粉—甘油培養基和甘油—酪素培養基成分均能促進(jìn)稀有放線(xiàn)菌的生長(cháng)。分離培養基中加入4種抗生素抑制細菌和真菌的生長(cháng)，有利于稀有放線(xiàn)菌分離。 

分離程序如下：沙漠土樣用溶液稀釋?zhuān)�溶液組成為：K₂HPO₄  0.38％ ， KH₂PO₄  0.12％ ， MgSO₄·7H₂O   0.51 ％ ，NaCl  0.25％， Fe₂ (SO₄ )₃·7 H₂O   0.005％ ， MnSO₄    0.005％。

選用3種分離培養基，分別是：

(1)葡萄糖一天門(mén)冬酰胺改良培養基： 葡萄糖 1 ％， 天門(mén)冬酰胺 0.1 ％， K₂HPO₄  0.1%， FeSO₄·7H₂O  0.0001％， MnC1₂·4 H₂O  0.0001％， ZnSO4·7H₂O  0.001％， 瓊 脂1.5％ ， pH7.0；

(2)淀粉一甘油培養基 ： 淀粉 1.0％， 甘油1.0％ ，(NH₄)₂SO₄  0.2 ％， CaCO₃  0.2％ ， KH₂PO₄   0.1％， MgSO₄·7 H₂O  0.1 ％ ， NaC1   0.1 ％， 脯氨酸 l ％ ， 瓊脂1.2％ ，pH7.0； 

(3)甘油 一酪素培養基 ：甘油 1.0％， 酪素0.03％ ，KNO₃ 0.2％ ， NaC1  0.2％ ， K₂HPO₄  0.2％ ， MgSO₄·7 H₂O  0.005％ ， FeSO₄·7 H2O  0.001％， CaCO₃   0.02％ ， 瓊脂1.8％ ， pH7.0。 

制霉菌素12.5m g／m L， 苯菌靈 20mg／mL ， 環(huán)絲氨酸 50mg／m L， 萘啶酸25 mg ／m L均加入3種分離培養基。稀釋涂布平板法分離，37℃培養 ，7 d 。

吉蘭糖膠是一種由Pseudomonas elodea產(chǎn)生的多糖。常用作植物組織培養的凝固基質(zhì)， 有促進(jìn)植物細胞生長(cháng)的作用。它也能促進(jìn)很多放線(xiàn)菌氣生菌絲的生長(cháng)及氣生孢子的形成 ， 如Sporichthya ，Actinobispora ，Planobispora， Plano—monospora等。因此，可以用作稀有放線(xiàn)菌分離培養基的凝固基質(zhì)。

通常分離產(chǎn)動(dòng)孢的游動(dòng)放線(xiàn)菌， 如Planobispora ，Planomonospora等， 利用它們孢子的游動(dòng)性， 可用誘餌捕集法、化學(xué)趨化法和離心法，如Nonomura等人用花粉或角蛋白誘餌捕集法成功地分離得到Actinoplanesspp．， Pilimelia和Planomonospora  spp ．； 化學(xué)趨化法選擇性分離Actinoplanes ，Catenuloplanes和Dactylosporangium ； 離心法將動(dòng)孢菌與鏈霉菌等不產(chǎn)動(dòng)孢的放線(xiàn)菌分開(kāi)， 選擇性分離稀有產(chǎn)動(dòng)孢的放線(xiàn)菌。Suzuki介紹了一些利用吉蘭糖膠特異性分離此類(lèi)放線(xiàn)菌的方法。 

2．1 選擇性分離 Sporichthya  Sporichthya  polymorpha在查氏瓊脂上形成的菌落小，難以辨別。而在HV吉蘭糖膠上形成的菌落大，便于快速鑒定。同樣，Sporichthya在幾丁質(zhì)瓊脂(Colloidal  chitin agar )、放線(xiàn)菌分離瓊脂 ( Actinomyceteisolation agar ) 、蛋清瓊脂 (Egg  a lbuminagar ) 和 HV瓊脂上形成的氣生菌絲都不及HV吉蘭糖膠豐富。實(shí)驗研究表明，Ca²⁺促進(jìn)Sporichthya polymorpha 生長(cháng) 。Ca²⁺加入HV吉蘭糖膠以提高對Sporichthya的選擇性 。

    Suzuki等用脫脂牛奶對土樣進(jìn)行預處理，可刺激Spofichthya孢子的運動(dòng)。需要引起注意的是，高溫能夠破壞脫脂牛奶中的刺激因子，所以脫脂牛奶不能進(jìn)行高溫滅菌。pH8.0時(shí)， 孢子運動(dòng)頻率最大。嗎啉丙磺酸 ( MOPS， pH8.0 ) 有助于 Sporichthya孢子的運動(dòng)，提高了分離效率。差速離心是分離動(dòng)孢菌的有效分離方法之一。脫脂牛奶結合離心法提高了分離的選擇性。分離程序如下：將風(fēng)干土樣在80℃干熱處理，l h ， 用含0.1％脫脂牛奶 (未滅菌) 的MOPS ( morpholinepropanesulfonic  acid，pH8.0) 浸液制成土壤懸液，27℃振蕩培養 1 h ，離心1000 r／m i n ，10 m i n，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后， 涂布HVG平板( CaC1₂ 2mM， 放線(xiàn)酮50μg／m L) ， 27℃培養，21～2 8d。 

2.2 選擇性分離  Planobispora  Planobispora通常形成棒狀孢囊，孢囊內包含一對縱生的孢子。這是Planobispora  典型的形態(tài)特征。Planobispora在一些標準分離培養基，如淀粉一硝酸鹽酪素瓊脂、 放線(xiàn)菌分離瓊脂和蛋清瓊脂上不能或稀疏形成孢囊。相比之下，在HSG上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊。有意思的是，當Planobom菌落數超50個(gè)時(shí)，在吉蘭糖膠培養基上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊，而菌落數少于20個(gè)時(shí)， 在氣絲上不能形成孢囊 。

HSG即腐殖酸微量鹽吉蘭糖膠。其中微量鹽包括FeSO₄·7H₂O，MnCl₂·4H₂O，ZnSO4·7H₂ O，NiSO₄·6 H₂O。它們在低濃度情況下，可以促進(jìn)孢囊的形成。在高濃度條件下，卻抑制孢囊的形成。堿性條件增加了有機物質(zhì)的降解，利于產(chǎn)孢囊的動(dòng)孢菌生長(cháng)。pH 9.0比中性pH更利于Planobispora孢囊的形成。同時(shí)，堿性條件也可以抑制優(yōu)勢菌鏈霉菌的生長(cháng)，提高對Planobispora的分離效果。當培養溫度為 32～37℃時(shí)，不利于非目的菌的生長(cháng)，而對Planobispora的生長(cháng)卻不構成影響。Suzuki等采用32℃培養，以減少水分的蒸發(fā)， 同樣達到選擇性分離的效果。

分離程序如下：風(fēng)干土樣在90℃干熱處理，1h ， 用CHES ( 5mM  pH9.0 ) ，脫脂牛奶0.1％ ， 吐溫80  0.01％， 三甲氧芐二氨嘧啶 100μg／mL和萘啶酸100μg／mL 制成土壤懸液 ，35℃振蕩l h ，離心1000g，10min ，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布HSG平板(三甲氧芐二氨嘧啶50g/ mL，萘啶酸50μg／mL ，依諾沙星20μg／mL ，氨芐青霉素鈉鹽2g／m L，硫酸鏈霉素1g／m L，放線(xiàn)酮50μg／m L，制霉菌素5 0μg／mL ，pH 9.0) ，32℃培養，14～21d 。 

2.3選擇性分離  Planomonospora  Planomonospora在一些分離培養基，如淀粉—硝酸鹽酪素瓊脂、 放線(xiàn)菌分離瓊脂和蛋清瓊脂，不能形成特征性孢囊。而在HSG上能夠產(chǎn)生豐富的孢囊。雖然在 HVA上， Planomonospora 也形成孢囊，但與HSG相比，稀疏得多。分離培養基的堿性環(huán)境利于Planomonospora孢囊的形成。CHES ( pH 9.0 ) 和 0.1 ％脫脂牛奶對動(dòng)孢菌的分離效果得到進(jìn)一步的驗證。

分離程序如下：風(fēng)干土樣在100℃干熱處理， 1 h ，用CHES ( 5 mM  pH 9.0 ) 和0.1％脫脂牛奶制成土壤懸液，32℃ 振蕩90 mi n ， 離心1000 g，10 m i n， 32℃再培養，1 h ， 涂布 HSG平板(三甲氧芐二氨嘧啶20μg／mL，萘啶酸20μg／m L， 依諾沙星20μg／m L，氨芐青霉素鈉鹽2g／mL，放線(xiàn)酮50μg／m L，制霉菌素50μg／mE )，35℃培養，14-21d 。 

2.4選擇性分離   Actinomadura   rugatobispora  Actinomadura   rugatobispora形成綠色的氣生菌絲，并在氣生菌絲上產(chǎn)生豐富的縱向排列的成對孢子，孢子表面多皺，有脊。  A．rugatobispora容易從形態(tài)特征進(jìn)行鑒別。在一些分離培養基上，如淀粉—硝酸鹽酪素瓊 脂、 放線(xiàn)菌分離瓊脂和蛋清瓊脂，A．rugatobispora不產(chǎn)生孢子。在HVA上，部分菌株當平板上菌落數只有5～20個(gè)時(shí)，產(chǎn)生稀疏的孢子。而在 HMG上，都能產(chǎn)生豐富的孢子。 

HMG即HVG中另外加入1g／L嗎啉丙磺酸( MOPS ) ，維持培養基pH8.0，利于A(yíng)．rugatobispora的生長(cháng)。分離培養基中加入硫酸慶大霉素和氨芐青霉素鈉鹽，用于抑制鏈霉菌等非目的菌的生長(cháng)。

分離程序如下：風(fēng)干土樣在120℃干熱處理，l h ，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋制成土壤懸液，涂布平板( HMG，硫酸慶大霉素100 g／mL， 氨芐青霉素鈉鹽20g／mL ，三甲氧芐二氨嘧啶50μg／mL， 萘啶酸10μg／m L，放線(xiàn)酮50μg／mL ， 制霉菌素 50μg／mL ) ， 35℃培養，2l～ 28 d 。

3 結束語(yǔ)