《水生微生物實(shí)驗法》——噬菌體的分離

噬菌體廣泛分布于自然界中，凡有細菌存在的地方，就有可能有其相應的噬菌體出現，那末就可能從海水、淡水和污水中，甚至是海泥或海產(chǎn)品中分離到噬菌體．

1 ．水中噬菌體的分離

常用的方法有濾菌器過(guò)濾法和加熱法兩種。

（1）過(guò)濾法：

取水樣300 毫升．加到100 毫升四倍濃度肉湯蛋白胨培養基內，再加入要分離的噬菌體的相應幼齡（如腸道細菌，經(jīng)6-8 小時(shí)培養）菌液3-4 毫升。在37℃孵育18-24 小時(shí)后，以每分鐘2000轉速離正沉淀30 分鐘．上清液經(jīng)賽氏濾菌器過(guò)濾，濾液鑒定．

（2）加熱法：

由于使用濾菌器過(guò)濾，常能吸附一部分噬菌體．若液體內噬菌體數量不多時(shí)，較難分離成功。而加熱法是根據噬菌體的耐熱性較一般無(wú)芽胞細菌高，故用較高的溫度將大部分細菌殺死，噬菌體仍保存著(zhù)，經(jīng)過(guò)多次反復，使液體中的噬菌體數量增多．最后經(jīng)過(guò)濾器的液體則含有眾多的噬菌體。

分離過(guò)程如下：將5-10 毫升污水加至10-20加毫升肉湯內，混合后加熱56 ℃小時(shí)或60℃半小時(shí)，取出離心（每分鐘1500轉）沉淀10 分鐘。取上清液2-4 毫升加于5-10 毫升肉湯培養基中，再加幼齡的相應菌液0.5毫升，在37℃ 培養18-20 小時(shí)，重新加溫，離心沉淀，取上清液加于肉湯中，加菌液、培養。如此反復3-4 次，最后經(jīng)賽氏濾菌器過(guò)濾，濾液供鑒定。

2 ．噬菌體的鑒定

將已知菌密密地涂布于肉湯蛋白胨瓊脂平板表面上，取待測的噬菌體液滴于平板上，每板分成三等分，每份1 滴．在37℃ 下培養24小時(shí)后．檢查有無(wú)透明菌斑出現，以說(shuō)明濾液中是否含有已知菌的相應噬菌體．

3 ．從貝類(lèi)中分離純化噬菌體

現已知有100多種病毒可從人或動(dòng)物腸道，或其他分泌物中排泄出來(lái)．而污染水源，而貝類(lèi)動(dòng)物及其他功物能聚集人類(lèi)致病性病毒．不少學(xué)者報道在海水、海洋浮游生物、海產(chǎn)貝類(lèi)和污水中發(fā)現，并分離出病毒。Moson 和Moclean( 1962 ）證實(shí)了生牡蠣妨內存在著(zhù)肝炎病毒。由于噬菌體對宿主有高度的特異性．則可利用其宿主作為敏感菌株去培養和發(fā)現它們，并根據其對宿主細胞的裂解，可在含有敏感菌株的平板培養基上出現可見(jiàn)的噬菌斑，且一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌斑，一種純的噬菌體具有相同形態(tài)大小的噬菌斑，故可將某種樣品中的噬菌體分離與純化。

（1）貝類(lèi)樣品的處理：取三個(gè)活牡蜘，用自來(lái)水洗刷貝殼表面，洗凈后用無(wú)菌水洗三次。放于鋪有經(jīng)高壓消毒的四層紗布的解剖盤(pán)上．取無(wú)菌解刻刀解剖其肉，無(wú)污染地研磨成漿，加無(wú)菌水100 毫升經(jīng)離心（2000轉／分25分鐘）去沉淀。

（2）增殖培養：取前步驟的上清液，全部加雙倍濃度肉湯蛋白胨培養基100 毫升及所要分離的噬菌體的幼齡宿主，如大腸桿菌、痢疾桿菌或葡萄球菌等懸浮液2 毫升，于37℃下培養12-24 小時(shí)。

（3）噬菌體裂解液的制備：

將增殖培養液以2500 轉／分離心15 分鐘，取上清液經(jīng)蔡氏濾器過(guò)濾，并將濾液倒入另一個(gè)無(wú)菌的三角瓶中，置37 ℃ 下培養過(guò)夜．以作無(wú)菌檢查．

（4）噬菌體的檢驗：上述濾液若無(wú)菌生長(cháng)，可作有無(wú)噬菌體存在的檢驗，其方法如下：

① 將宿主菌懸液涂布接種于肉湯瓊脂平板培養基上。

② 待平板面菌液干后，按三等分各滴上1 小滴無(wú)菌濾液于平板上。將平板置于37 ℃培養過(guò)夜，如果濾液內有相應宿主的噬菌體存在，則加濾液處便無(wú)宿主菌生長(cháng)，而呈蠶食狀的空斑，即噬菌斑，這證明了噬菌體存在。

③ 如已證明有噬菌體存在，可再將濾液接種于已同時(shí)接種有宿主菌的肉湯培養基內，如此重復移種數次，即可使噬菌體增多。

4.純化培養

（1）將含有噬菌體的濾液用肉湯液體培養基，按10倍稀釋法稀釋成10^-1-10^-5等5 個(gè)稀釋度。

（2）向裝有4 毫升已融化的，保溫在50℃左右水浴箱中的瓊脂管加0.1毫升宿主桿菌液，并對號加入0.1毫升各稀釋度的濾液，搖勻。然后，對號傾入直徑為9厘米的裝有10 毫升已凝固的底層瓊脂平皿上．

（3）待倒入的上層瓊脂凝固后．置于37℃培養18-24 時(shí)。

（4）待出現噬菌斑后，用接種針在選定的噬菌斑刺一下，接種于含有宿主菌的肉湯培養液中，于37℃ 培養18-24 小時(shí)，再依上述方法稀釋?zhuān)�倒平板分離，直到平板上出現的噬菌斑形態(tài)大小一致．則表明已獲得純化的，相應于宿主菌的噬菌體。

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