《水生微生物實(shí)驗法》——水中霍亂弧菌的分離檢驗

感染了霍亂弧菌可能引起急性傳染病——霍亂．1883年世界上霍亂大流行時(shí)，科克（Koch）在埃及的病人體內分離培養而且獲得證實(shí)霍亂弧菌的存在。解放后在我國沒(méi)有發(fā)現此疾病的流行。但由于病人的吐瀉物可能污染水源，不能保證在遼闊的沿岸、港灣、河口等處沒(méi)有霍亂菌的存在，因此對水源中霍亂弧菌的分離檢測，有利于預防霍亂疾病的發(fā)生。

1 ．培養基制備

（1）堿性蛋白胨水培養液：

NaNO₃  2 克

NaCl   5 克

蛋白胨10 克

蒸餾水1000 毫升

將上述三種成分溶解于水后，用15%氫氧化鈉溶液約10 毫升調pH 為8.8-9.0．于121℃下滅菌20 分鐘。

（2）雪氏（Senenray ）蛋白胨水．

蛋白胨20克

NaCl 30 克

蒸餾水1000毫升

將前兩種溶解于水．調pH8.4，于121℃ 蒸汽下滅菌20分鐘。

（3）阿倫森氏（Aronson ）培養基：

3%肉膏瓊脂（pH7.4-7.6) 100 毫升

10%無(wú)水Na₂CO₃溶液5-6 毫升

20%蔗糖溶液5毫升

20%糊精溶液3毫升

堿性復紅酒精飽和溶液0.4 毫升

10 ％無(wú)水Na₂SO3溶液2 毫升

制法如下：

① 將己滅菌的肉膏瓊脂加熱溶化加入碳酸鈉溶液6 毫升混合。

② 加蔗糖、糊精、復紅及亞硫酸鈉溶液，混合，置于阿諾德氏滅菌器內，以間歇蒸汽滅菌15分鐘，此時(shí)可有部分沉淀形成．

③ 將上層清晰的培養基倒于培養皿，制成平板，備用。但不得保存過(guò)久，一般在3 天內用完。

（4）亞碲酸鉀蛋白胨水及亞碲酸鉀瓊脂平板成分及制法：

① 可溶性淀粉0.5克

蒸餾水10 毫升

將可溶性淀粉溶于蒸餾水混合，煮沸2 分鐘（待淀粉透明即可）.

② 牛肉膏0.3-0.5克蛋白胨1 克

KNO₃ 0.1克

MgCl₂ 0.1克

NaCl  1 克

蒸餾水9O 毫升

③ 0.2%亞碲酸鉀水溶液，用賽氏濾菌器過(guò)濾，或阿諾德氏滅菌器加熱100℃ 30 分鐘．

④ 制法；將② 中諸物混和加熱至全部溶解，將① 全部加入，待冷至50-60℃ ，滴定pH 為9.2, （用0.04％溴麝香草酚藍作指示劑），分裝于三角瓶中每瓶100 毫升，112.6℃ 蒸汽下滅菌20 分鐘。使用前每100毫升加入已滅菌的0.2%亞碲酸鉀水溶液1 毫升及0.5%薔薇酸酒精溶液l 毫升，混合后以無(wú)菌操作技術(shù)分裝于無(wú)菌試管中，每管5-10 毫升．

如果制備固體培養基時(shí)，可在② 液內加2-3 %瓊脂，其他各步與上述相同，最后傾入平皿，制成平板培養基．

2 ．增菌培養

取水樣900 毫升加到內含5%氯化鈉和10%堿性質(zhì)白胨水的無(wú)菌混合液100 毫升（pH9.0）于37 ℃ 下培養24 小時(shí)�；蛉∷畼�1-2升，在賽氏濾器上過(guò)濾，將其濾紙放于堿性蛋白水溶液、或放于雪氏蛋白胨水中作增菌培養24 小時(shí)．

3 ．分離培養

取少量的增菌培養液在阿倫森氏平板培養基上涂布接種．于37 ℃ 下培養12-24 小時(shí)�；魜y弧菌的菌落呈鮮紅色，大腸桿菌群的菌落較小呈淡紅色。

如果將增菌液涂布于亞蹄酸鉀瓊脂平板．在37 ℃ 下培養8-12 小時(shí)，由于其中薔薇酸抑制革蘭氏陽(yáng)性細菌．亞碲酸鉀抑制其他革蘭氏陰性菌生長(cháng)，僅霍亂弧菌能還原亞碲酸鉀，形成黑色菌落。因此，這種培養基更適合于分離霍亂弧菌。

4 ．鏡檢

挑取典型菌落制片．染色鏡檢和懸滴鏡檢，若為革蘭氏陰性，運動(dòng)活潑的弧菌，則可初步確定所分離的是霍亂弧菌。

5 ．生理生化檢驗

根據霍亂弧菌的生理生化特征可分為四個(gè)生物類(lèi)型，進(jìn)行生理生化試驗時(shí)可按2-8 的項目進(jìn)行。

表2-8 霍亂弧菌四個(gè)生物型的特征區別

注：d多種生化反應，(+)^o為遲緩反應。+陽(yáng)性反應，-陰性反應