《水生微生物實(shí)驗法》——水中志賀氏菌的檢驗和分離

志賀氏菌是一種引起痢疾病的痢疾桿菌，由日本細胞學(xué)家志賀首先發(fā)現的，故將這一屬的細菌稱(chēng)為志賀氏菌屬。根據生化反應、抗原的不同可分成四類(lèi)：

① 志賀氏痢疾桿菌和斯米茨氏痢疾桿菌

② 弗氏痢疾桿菌

③ 博伊德民（Boyd ）痢疾桿菌。

④ 宋耐（Sonnei ）痢疾桿菌。

1 ．培養基成分及制備

（1） G . N ．增菌液：

胰蛋白胨20 克

葡萄糖1 克

甘露醇2 克

枸櫞酸鈉5 克

去氧膽酸鈉0.5 克

K₂HPO₄  4 克

KH₂PO₄   1.5 克

NaCl  5 克

蒸餾水1000 毫升

pH 7.0

將上述各物溶于水中，加熱使溶解，校正pH 過(guò)濾，分裝于試管，每管5 毫升。在115℃ 下蒸汽滅菌20 分鐘．保存于冰箱待用。

（2）沙門(mén)氏，志賀氏菌屬瓊脂基（簡(jiǎn)稱(chēng)S .S ．瓊脂）:

膘蛋白胨5 克

乳糖10 克

膽鹽8.5-10 克

枸櫞酸鈉8.5-13克

Na₂S₂O₃·5H₂O   8.5-10克

枸櫞酸鐵0.5克

牛肉膏5 克

瓊脂17-20克

0.5%中性紅水溶液4.5毫升

0.1%煌綠溶液0.33毫升

蒸餾水1000毫升

將除中性紅和煌綠溶液外的其他成分煮沸溶解，調pH 為7.1 ，加入中性紅和煌綠充分搖勻，再煮沸l-2 次，用牛皮紙包好瓶門(mén)。冷至55℃ 左右，傾注于滅菌平皿成平板培養基．存于暗處備用。注意事項如下：

① 此培養基切忌高壓滅菌，或加熱的時(shí)間過(guò)長(cháng)。

② 配成平板培養基后．在接種前應先使培養基表面干燥，便于分離接種．一般的方法是倒放于培養箱l 小時(shí)左右，當日使用．

③ 此培養基質(zhì)量的優(yōu)劣主要是與膽鹽有關(guān)。要獲得比較滿(mǎn)意的結果．每批膽鹽購到后，選擇若干菌株，于實(shí)驗室內用S.S瓊脂作對照試驗。必要時(shí)可適當調節鹽類(lèi)和膽鹽的用量。要求達到：

a ．沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬均能生長(cháng)，并保持在S.S瓊脂上應有的特征。

b ．對大腸桿菌有一定的抑制能力．生長(cháng)的大腸桿菌呈桃紅色。

c．無(wú)膽酸擴散沉淀現象。

④ 煌綠溶液配制后，應在10 天內使用，過(guò)久不宜使用。

( 3 ）雙糖鐵瓊脂．

上層成分：血消化湯500 毫升

瓊脂6.5克

Na₂S₂O₃·5H₂O   0.1克

FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O   0.1克

乳糖5克

0.4%酚紅溶液2.5 毫升

下層成分：血消化湯500 毫升

瓊脂2 克

葡萄糖1 克

0.4%酚紅溶液2.5毫升

制法如下：

上層：

① 將血消化湯和瓊脂混合，加熱溶解，調pH 為7.8-8.0，用3-4 層的紗布過(guò)濾。

② 加入其他成分搖勻，使其溶解，裝入燒瓶中。

③ 在115℃蒸汽下滅菌10 分鐘．取出，立即放于56℃ 的水浴內，待用。

下層：

① 與② 同上層的① 與② 步驟，但分裝試管中，每管2 毫升。

③ 在115℃蒸汽滅菌15分鐘后，讓其直立凝固。

凝固后．按無(wú)菌操作將上層培養基乘熱裝于下層培養基上面，每管約裝1.5毫升．制成斜面，待用.

2 ．濾膜濃集

一般情況下，水中的志賀氏菌的數量不多，不容易檢驗分離出來(lái)，必須先通過(guò)濃集、增菌培養階段，而后再進(jìn)行分離鑒別．

濾膜濃集法．適于澄清的水樣．取一定量的水樣。按分離基本技術(shù)中的超濾膜法進(jìn)行。

3 ．增菌培養

將濾膜的全部或部分放入G . N ．增菌培養基，在37℃下培養，培養時(shí)間不得超過(guò)24 小時(shí)。因培養的時(shí)間長(cháng)了，會(huì )使綠膿桿菌、變形桿菌等非致病性細菌過(guò)度增長(cháng)。

4 ．平板鑒別培養

用少量的增菌液在S.S平板培養基上涂布均勻，于37℃下培養24 小時(shí)。沙門(mén)氏菌與志賀氏菌因不發(fā)酵乳糖而菌落不著(zhù)色，呈半透明，如有大腸桿菌群細菌生長(cháng)，則菌落呈紅色。某些變形桿菌與沙門(mén)氏菌的菌落中心也可呈黑色。

5 ．雙糖鐵斜面培養

挑選上述可疑菌落接種于雙糖鐵培養基，在37℃ 下培養18-24 小時(shí)，由于大腸桿菌群在此種培養基上僅僅受抑制而不長(cháng)，并沒(méi)有被殺死。故挑取菌落時(shí)應僅挑其中心部分，否則四周的雜菌也可能一并被挑入，影響下一步鑒定工作的順利進(jìn)行，也影響鑒定效果的正確性。

志賀氏菌的菌落和沙門(mén)氏菌相似，無(wú)色、半透明、邊緣整齊，但較小和較為透明些，且更扁平。宋氏志賀氏菌的菌落較大，邊緣較不整齊，且因遲緩發(fā)酵乳糖，在S.S．瓊脂平板上的菌落有時(shí)呈玫瑰紅色．所以供生化鑒定的菌落應多挑幾個(gè)以防遺漏．

6 ．一般的生化鑒定

經(jīng)雙糖鐵斜面培養，如果在底層葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無(wú)動(dòng)力，不產(chǎn)生硫化氫，上層斜面乳糖不分解，則可視為可疑的志賀氏菌，可進(jìn)行生化和血清學(xué)檢驗。

生化檢驗項目包括：葡萄糖、甘露醇，麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質(zhì)、硫化氫、動(dòng)力、尿素。志賀氏菌屬能分解葡萄糖、但不產(chǎn)氣（弗氏志賀氏菌b 型有時(shí)能產(chǎn)生少量氣體）; 一般不分解乳糖及蔗糖（宋氏志賀氏菌對乳糖及蔗糖遲緩發(fā)酵產(chǎn)酸）；志賀氏菌均不產(chǎn)生硫化氫．不分解尿素，無(wú)動(dòng)力，對甘露醇、麥芽糖的發(fā)酵及吲哚的產(chǎn)生，則因菌株不同而異。在37℃培養后無(wú)動(dòng)力者，必要時(shí)，放室溫觀(guān)察4-5 天．

如遇多價(jià)血清玻片凝集試驗為陰性，而生化反應符合上述情況時(shí)，可加做肌酵、水楊苷、V . P ．、枸櫞酸鹽、氰化鉀等試驗，志賀氏菌屬均為陰性反應。吲哚產(chǎn)生陽(yáng)性的無(wú)動(dòng)力菌株．可加做5 %乳糖發(fā)酵管和葡萄糖銨試驗，志賀菌屬均為陰性。

7 ．系統生化檢驗

表2-7 志賀氏菌屬的系統生化檢驗

注．十90 %以上陽(yáng)性；-90%以上陰性；( + ）遲緩陽(yáng)性；d 有不同生化型．十/-多數陽(yáng)性：-/+多數陰性．少數遲緩陽(yáng)性．

志賀氏菌屬的生化反應和抗原特性，有時(shí)產(chǎn)生變異．故必要時(shí)，按系統的生化特性作鑒定，凡符合表2-7 的菌株可鑒定為志賀氏菌屬。如果在水樣中檢驗到志賀氏菌，則該水質(zhì)已受污染．視單位水樣中的志賀氏菌數量，可確定受病原菌污染的程度。

上一篇：《水生微生物實(shí)驗法》——水中沙門(mén)氏菌的分離

下一篇：《水生微生物實(shí)驗法》——水中葡萄球菌的分離與觀(guān)察