《水生微生物實(shí)驗法》——濾膜法分離檢驗水中大腸桿菌群

（十八）濾膜法分離檢驗水中大腸桿菌群

人們在檢查病原菌污染的飲用水、近海海水和水源水時(shí)，經(jīng)常以檢查水中大腸桿菌的數量作為指標（我國《生活飲用水衛生標準》 規定：每升水中大腸桿菌不多于3 個(gè)，可作為飲用水。）來(lái)說(shuō)明水受人畜糞便污染的程度。因水中由病人和病畜或帶菌者的糞便污染而來(lái)的病原菌數量很少．不易直接檢查，而水中的大腸桿菌群，如果超過(guò)一定數量．就說(shuō)明被檢查水可能有病菌存在。實(shí)際上這種檢查過(guò)程，首先是應用選擇性培養基，將大腸桿菌群從雜菌中分離出來(lái)的一種過(guò)程。

其檢驗方法有兩種：一是發(fā)酵法，即根據大腸桿菌群具有能分解乳糖生成CO₂等氣體的特性酶，而其他腸道細菌如志賀氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬，由于沒(méi)有這種特性酶，不能產(chǎn)氣，可被區別開(kāi)來(lái)。另一種是濾膜法，它是利用細菌不能通過(guò)微孔性薄膜．在抽濾下液體濾過(guò)而細菌被截留在膜上．然后用具有高度選擇性的品紅亞硫酸鈉培養基（遠滕氏培養基）分離培養，本實(shí)驗將應用這種方法分離鑒定大腸桿菌群．此法較簡(jiǎn)單而快速，發(fā)酵法較之繁雜，所需的時(shí)間也較長(cháng)。

1 ．培養基的成分及制備

（1）品紅亞硫酸鈉培養基：

蛋白胨10克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10克

瓊脂20克

K₂HPO₄ 3.5克

無(wú)水Na₂SO₃ 5 克左右

5 %鹼性品紅乙醇溶液20毫升

蒸餾水1000毫升

（2）儲備培養基的制備：

① 將瓊脂加于800毫升蒸餾水中，加熱溶解后，加磷酸氫二鉀、蛋白胨、牛肉膏及酵母浸膏，混勻，溶解，以蒸餾水補足1000毫升、調pH 為7.2-7.4 。

 ② 趁熱用脫脂棉或絨布過(guò)濾后加入乳糖，混勻后定量分裝于錐形瓶中。包裝后于115℃ 蒸汽下滅菌20 分鐘，存于冷暗處備用。

（3）平板培養基的制備：

① 加熱溶化上述配制的儲備培養基。

② 據瓶?jì)扰囵B的數量按2%的比例吸5%鹼性品紅乙醇溶液注入無(wú)菌試管中．

③ 同樣按比例（5‰）稱(chēng)無(wú)水亞硫酸納置于滅菌的另一空試管中煮沸10分鐘滅菌后，例入鹼性品紅乙醇液中混合后，全液加到以融化的儲備培養基內，充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。

④ 立即將此液分裝于無(wú)菌培養皿中，制成平板培養基，冷凝后置于冰箱內備用，但不宜存過(guò)久。此種培養基專(zhuān)供濾膜法測定大腸桿菌群時(shí)用。據使用情況，培養基中鹼性品紅用最也可適當減少。

（4）乳糖蛋白胨半固體培養基成分及制法：

蛋白胨10 克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10 克

瓊脂5 克左右

蒸餾水1000毫升

將上面各成分放于水中加熱溶解混勻，調pH 為7.2-7.4 ，過(guò)濾，分裝于小試管內，置高壓蒸汽鍋內，115℃下滅菌20分鐘，冷后放冰箱內保存。但存放不宜超過(guò)兩周。此培養基制成后．常用已知的大腸桿菌釋菌株作鑒定．應在6 -8 小時(shí)后產(chǎn)生明顯的氣泡．

2 ．濾膜與濾器的滅菌

（1）將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水， 于沸水溶中煮沸滅菌三次．每次15 分鐘。前二次煮沸后需換水洗滌2-3 次，以除去殘留的溶劑。

（2）濾器滅菌，用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用紗布和牛皮紙包裝好于121℃ 蒸汽下，高壓滅菌20 分鐘

3 ．分離培養

（1）過(guò)濾水樣（海水、飲用水、自來(lái)水，水庫水及各種水源水），用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，使粗糙面向上，貼放于已滅菌的濾器上，穩妥地固定好濾器，將水樣注入濾器內，加蓋，打開(kāi)濾器閥門(mén)．在負0.4 大氣壓下抽濾，水樣抽完后，再抽氣5 秒鐘，關(guān)上濾器閥門(mén)，取下濾器。

（2）用滅菌攝于夾濾膜邊緣，移放在平板培養基上，使濾膜的截留細菌面向上，另一面完全緊貼培養基，兩者之何不得留有氣泡，重復以上的步驟，再接種一、二個(gè)平板．倒置培養皿于37℃下培養20-24 小時(shí)。

（3）觀(guān)察。挑選符合下列特征的菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢。

紫紅色，具有金屬光澤的菌落．

深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落，

淡紅色，中央色較深的菌落。

④ 凡屬革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢桿菌，應將其穿刺接種于乳糖蛋白胨半固體培養基（接種前須將此培養基放在水溶中煮沸排氣，待冷凝后使用），經(jīng)37℃培養6-8 小時(shí)，若沿刺種線(xiàn)有氣泡產(chǎn)生者，則可判定為所分離檢驗的細菌群是大腸桿菌群。

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