《水生微生物實(shí)驗法》——幾丁質(zhì)分解菌的分離

（十二）幾丁質(zhì)分解菌的分離

幾丁質(zhì)也稱(chēng)殼多糖或稱(chēng)甲殼素，廣泛地分布于海沙、海泥、海水、淡水和土壤，以及吃幾丁質(zhì)的頭足類(lèi)動(dòng)物的胃腸，蝦、蟹體表中．如幾丁色色桿菌、嗜幾丁桿菌、呈色幾丁桿菌和蝕幾丁芽孢桿菌等。它們將幾丁質(zhì)分解成中間產(chǎn)物醋酸與還原糖，最終產(chǎn)物為二氧化碳與氨．

1 ．幾丁質(zhì)培養基制備

（1）幾丁質(zhì)的制�。合磧粜窔せ驅⒋蠛Ｎr殼浸泡在l%HCl 中7 天，( 2 天換鹽酸溶液1 次）脫去殼的鈣質(zhì)，使殼變得柔軟而有韌性。然后用水洗凈外殼，剪成1×3 厘米殼條。

用2 %氫氧化鉀溶液浸泡殼條10 天，每2 天加熱一次，加熱的溫度低于沸點(diǎn)為宜，借以除去幾丁質(zhì)以外的其他物質(zhì)，如色素和蛋白質(zhì)等。

用蒸餾水洗凈殼條上的堿，然后用乙醇抽提數次．直到全部顏色脫凈為止。

這樣的幾丁質(zhì)適用于液體培養基培養未純化的細菌，和保存幾丁質(zhì)分解菌．

如用于瓊脂培養基中的幾丁質(zhì)，必須將這種去凈雜質(zhì)的幾丁質(zhì)研細分散于培養基中．這可用去雜質(zhì)的若干幾丁質(zhì)條放于3 升的瓶中，在另一個(gè)燒瓶中準備好1500毫升冷水，用100 毫升5%的硫酸加到裝幾丁質(zhì)條的燒瓶中，當幾丁質(zhì)剛溶解完時(shí)，迅速加入已準備好的1500 毫升冷水將酸稀釋?zhuān)�靜置過(guò)夜，使幾丁質(zhì)重新沉淀出來(lái)，輕輕倒出上清液．反復離心，洗滌沉淀至使石蕊呈中性�；驅�幾丁質(zhì)放在一個(gè)透水的玻璃紙袋里懸掛在流水中，使酸透析完全。

按1：10，使幾丁質(zhì)重新懸浮于水中。取5 毫升懸液于直徑10 厘米培養皿時(shí)，以仍呈輕微而又清晰的乳白色為宜。

將懸液分裝于試管中，每管10 毫升，于121 ℃ 下滅菌15 分鐘。

（2）幾丁質(zhì)無(wú)機鹽培養基制備：

K₂HPO₄   1.0克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

NaCl 海水菌用30克   淡水菌0.5克

CaCl₂·2H₂O   0.1克

FePO₄·2H₂O  0.001 克

NH₄Cl 1.0克

H₂O  1000毫升

溶解上列無(wú)機鹽類(lèi)，調pH 為7.0分裝于試管中，每管10毫升，各管加l 條去雜質(zhì)的幾丁質(zhì)條，于121℃ 蒸汽下滅菌15分鐘，冷后保存待用，

（3）無(wú)機鹽瓊脂培養基：將上述培養基的無(wú)機鹽成分全部溶于水后，加入2％的瓊脂（不加幾丁質(zhì)）加熱溶解之，調pH 為7.0 ，分裝于試管中，分與每管5 毫升和10 毫升的兩種，在121 ℃蒸汽中滅菌15分鐘.

（4）幾丁質(zhì)瓊脂平板培養基：融化10 和5 毫升的無(wú)機鹽瓊脂培養基各若干管（視實(shí)驗要求），于水浴中冷至45℃ 將一份10 毫升培養基倒入無(wú)菌的培養皿，靜置．

在5 毫升培養基管中加入0.5 毫升溫熱的幾丁質(zhì)懸液，充分混和，倒入上面平皿中的無(wú)機鹽瓊脂平板上層。

這種作法能縮短幾丁質(zhì)分解菌作用子幾丁質(zhì)的時(shí)間。

2 ．幾丁質(zhì)分解菌富集培養

取樣品接種于含有幾丁質(zhì)條的上述無(wú)機鹽培養基中，在適溫下培養至幾丁質(zhì)產(chǎn)生明顯的分解后，移種到裝有同樣培養基的試管內，再培養待用。

3 ，分離和純化培養

當分解幾丁質(zhì)變快時(shí)，將無(wú)機鹽增菌培養液涂抹或劃線(xiàn)于幾丁質(zhì)瓊脂平板上，于適溫下培養，待長(cháng)出菌落后，可挑其菌苔，按一般方法純化，保存于液體培養基中．當幾丁質(zhì)條接近消失時(shí)再移種。

4 ．供參考的培養基

（1）幾丁質(zhì)瓊脂培養基：

K₂HPO₄  0.7克

KH₂PO₄   0.3克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

FeSO₄·7H₂O   0.01克

ZnSO₄   0.001克

瓊脂10 克

蒸餾水1.0升

Ph7.0

以上為基礎培養基，以121 ℃ 蒸汽滅菌20 分鐘、每100 毫升加20毫升膠體幾丁質(zhì)懸浮液和5 毫克放線(xiàn)菌酮，或制成用于分離放線(xiàn)菌的雙層平板．底層用基礎瓊脂和放線(xiàn)菌酮，上層用膠體幾丁質(zhì)培養基。

（2）膠體幾丁質(zhì)的制備：取凈幾丁質(zhì)15 克加濃鹽酸100 毫升，于冰浴中攬拌20分鐘，離心，將上清液倒入冷蒸餾水中使再沉淀，同時(shí)將沉淀物用濃鹽酸再行處理，如此重復數次。最后加足蒸餾水于沉淀物中，攪拌，便成奶油狀，再用氫氧化鈉溶液調pH 至7.0 ，分裝入廣口瓶，每瓶20毫升121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鐘。

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