細菌學(xué)中的診斷新技術(shù)（2）

　　隨著(zhù)分子微生物生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對病原微生物的鑒定已不再局限于對它的外部形態(tài)結構及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學(xué)水平上研究生物大分子，特別是核酸結構及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術(shù)中，核酸探針(Nuclear acid probe)和聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction)以其敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)成為世人矚目的生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，業(yè)已逐步應用于食源性病原菌的檢測。

　　1．核酸探針

　　　將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區段形成雜交雙鏈，從而達到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認識到特異性核苷酸序列有標記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。

　　2．核酸探針的類(lèi)型

　　根據核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據選用基因的不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA 發(fā)生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類(lèi)探針檢測的基因相當保守，包括大部分rRNA，因為他既可能在一種微生物中出現，又可代表一群微生物。如應用rRNA探針檢測作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli.選擇探針的原則是只能同檢測的細菌發(fā)生雜交反應，而不受非檢菌存在的干擾。

　　3．核酸探針的應用：

　�。�1）．用于檢測無(wú)法培養，不能用作生化鑒定、不可觀(guān)察的微生物產(chǎn)物以及缺乏診斷抗原等方面的檢測，如腸毒素。

　�。�2）．用于檢測同食源性感染有關(guān)的病毒病，如檢測肝炎病毒，流行病學(xué)調查研究，區分有毒和無(wú)毒菌株。

　�。�3）．檢測細菌內抗藥基因。

　�。�4）．分析食品是否會(huì )被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。

　�。�5）．細菌分型，包括rRNA分型。

　　4、核酸探針的特點(diǎn):

　　4.1.探針的特異性:

　　探針檢測技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是特異性，就是說(shuō)一個(gè)適當組建的DNA探針能絕對特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應。對食品檢測而言，就是不與樣品中內源性雜菌和樣品自身DNA發(fā)生非特異性反應。

　　以往檢測方法檢測的是基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物）。檢測這種物質(zhì)受多種因素影響。比如食品中微生物因受應激損傷（高溫、冷凍、化學(xué)制劑等）會(huì )導致基因組的變化，從而引起其表達產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測的是基因本身，它能識別基因本身的變異，不受基因表達產(chǎn)物的影響。常規免疫學(xué)方法檢測抗原、抗體，它們都是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影響發(fā)生變異，就會(huì )導致其產(chǎn)物的變化，影響抗原抗體間的反應，使檢測特異性下降。

　　檢測病毒主要通過(guò)組織培養后，檢測病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)囊膜，即使采用超低溫保存，有時(shí)也會(huì )引起編碼蛋白質(zhì)囊膜基因的變化，而采取DNA探針檢測病毒則不用改變其蛋白質(zhì)結構，而只需檢測是否有相應特異性的編碼蛋白質(zhì)囊膜的病毒靶DNA序列。

　　另外，核酸之間的識別連接比抗原抗體準確，并且探針檢測比免疫學(xué)方法靈活。盡管看來(lái)形成抗原抗體復合物比核酸雜交快，但能通過(guò)加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，從而提高反應速度，核酸比蛋白質(zhì)耐受高溫（100℃）、有機溶劑、螯合劑和高濃度工作液的破壞能力強，所以用比提取制備蛋白質(zhì)強烈的多的方法制備核酸，不會(huì )影響雜交反應。當然RNA探針除外，因為RNA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測用RNA。

　　核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件，如在不嚴格的條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結合力比嚴格條件下穩定。

　　探針長(cháng)度也會(huì )影響反應的特異性，一般加Formamide增強反應特異性。

　　4．2．探針的敏感性

　　研制核酸探針是為了檢測出單個(gè)病毒和細菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標記系統。³²P標記物通�？蓹z出10^-8摩爾特異DNA片段，相當于0。5pg,1000個(gè)堿基對的靶系列，相當于1000---10000個(gè)細菌。用親和素標記探針檢測1小時(shí)培養物DNA含量在110pg，兩者敏感性大致相同，而血清學(xué)方法只能達到1ng的水平。

　　延長(cháng)培養時(shí)間，增強信號強度能提高探針的敏感性。

　　非放射性物標記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附，比放射性物標記探針背景干擾小。

　　制備食品樣品時(shí)，因機械均漿而導致菌體破裂，產(chǎn)生較高的背景干擾會(huì )影響檢測敏感性。

　　在探針上加生物素化的核苷酸長(cháng)尾能使檢測敏感性提高10倍。

　　細胞中rRNA比DNA多，檢測rRNA的探針比DNA敏感。通過(guò)擴增DNA含量也能提高檢測敏感性。

　　4．3．探針檢測技術(shù)中存在的問(wèn)題

　　檢測一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測速度快，但要達到檢測量還要對樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養，任何一種方法不可能有100%的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題。

　　DNA探針還不能完全取得常規檢驗提供的細菌特性的信息，如在菌株生物型鑒定、血清型和抗藥基因上有不足之處。

　　檢測食品時(shí)，樣品中待檢菌量低雜質(zhì)成分復雜，樣品DNA純度不夠高等都會(huì )限制探針檢測的敏感性。

　　探針檢測是分析基因序列，對毒素污染的食品有時(shí)因樣品中不含產(chǎn)毒菌而無(wú)法檢測，因為盡管探針能檢測活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能檢測其表達產(chǎn)物，所以在評價(jià)食品安全衛生上存在一定的局限性。

　　5．核酸探針雜交技術(shù)原理

　　根據完成雜交反應所處介質(zhì)的不同，分成固相雜交反應和液相雜交反應。固相雜交反應是在固相支持物上完成的雜交反應，如常見(jiàn)的印跡法和菌落雜交法。事先破碎細胞使之釋放DNA/RNA然后把裂解獲得的DNA/RNA固定在硝基纖維素薄膜上，再加標記探針雜交，依顏色變化確定結果，該法是最原始的探針雜交法容易產(chǎn)生非特異性背景干擾。

　　液相雜交法指雜交反應在液相中完成，不需固相支持，優(yōu)點(diǎn)是雜交速度比固相雜交反應速度快5-10倍。缺點(diǎn)是為消除背景干擾必需進(jìn)行分離以除去加入反應體系中的干擾劑。

　　分離雜交DNA探針的方法有兩種，一種用羥磷灰石，它僅能與雙股DNA結合，單股DNA在和羥磷灰石結合前必須先同一個(gè)探針或互補單鏈雜交成雙股DNA才可。當溶液中DNA通過(guò)羥磷灰石柱子時(shí)，只有雙股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脫下來(lái)，最后用激活的標記物檢測。另一種分離方法運用磁球技術(shù)把探針與小磁球連接，再用多核苷酸尾部連接第二探針，不用離心就能分離DNA與未雜交DNA。短寡核苷酸能和磁球連接，也能從磁球上洗脫，在以mRNA系統進(jìn)行靶循環(huán)的檢測過(guò)程中，該方法能將背景干擾降低2---3個(gè)數量級，從而達到較高的敏感性。

　　5．1．夾心雜交法（Sandwish hybridization）

　　它由三種不同作用的核酸成分組成：（1）：與固相支持物連接的捕獲探針；（2）產(chǎn)生信號的檢測探針；（3）靶核酸序列。靶核酸在這個(gè)體系中起連接捕獲探針和信號檢測探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能于上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質(zhì)后能得到一個(gè)清晰的檢測信號，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號探針無(wú)法連接在固相物上，洗脫后固相物上無(wú)信號應答。

　　5．2．核酸置換雜交分析法 （Strand displacement assay）

　　它是在夾心雜交法的基礎上改進(jìn)的一種方法。先獎捕獲探針連接在固相物上，然后在此探針上以微弱的結合方式雜交一個(gè)短小能產(chǎn)生信號的核酸，如果靶DNA能與捕獲探針雜交可通過(guò)競爭置換出帶信號的核苷酸片段，在檢測過(guò)程中產(chǎn)生信號的單股核酸可轉化為ATP，再加入熒光素酶，用生物發(fā)光分析法檢測。其優(yōu)點(diǎn)在于背景干擾小，敏感性強。缺點(diǎn)為不是所有捕獲探針都能應用這種方法雜交，且信號探針會(huì )不斷地從捕獲探針上脫落。

　　　5．3．浸染棒法 （Dipstick assay）

　　它是夾心雜交法最新的一種改進(jìn)方法。它用兩種探針，其中一個(gè)進(jìn)行標記，另一個(gè)是單核苷酸長(cháng)鏈，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹與多聚腺苷酸長(cháng)鏈探針能互補配對的堿基成分，即多聚胸腺嘧啶，盡管雜交反應在溶液中完成，但浸染棒是完成最后檢測的固相支持物。它比薄膜法能更有效地減少背景干擾，提高檢測效率。亦已用于沙門(mén)氏菌和李氏菌的檢測。對熒光素標記探針可用辣根過(guò)氧化物酶標記熒光素抗體，通過(guò)比色法檢測復合物濃度。

　　6.聚合酶技術(shù)（PCR）的原理及其發(fā)展

　　6．1．PCR技術(shù)原理

　　為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴增，增加DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動(dòng)力學(xué)為基礎，則能定量分析。1983年Millus 和Cetus發(fā)明了最基本的擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量的方法·聚合酶鏈反應即PCR法。PCR法建立在三步重復發(fā)生反應的基礎上。①通過(guò)熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應。溶液中核苷酸通過(guò)酶聚合成相互補對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA，成為下次PCR復制的模板。因此每次循環(huán)特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴增經(jīng)過(guò)20-40次循環(huán)能引起100萬(wàn)倍的擴增。在PCR反應中引入Taq聚合酶使反應得以半自動(dòng)化和簡(jiǎn)便反應程序。用擴增DNA進(jìn)行的PCR反應具有無(wú)與倫比的優(yōu)越性。如用同位素標記兩種基因（Lac Z 和 Lam B）的，探針做PCR反應檢測水源中E.Coli，檢測量達到1-0.5 個(gè)細菌/100ml。為快速準確的檢測食品中污染的病原微生物帶來(lái)一線(xiàn)曙光。

　　　當然PCR也存在缺點(diǎn)，主要是系統容易受外源DNA的污染，并隨樣品中待檢DNA一起擴增。特別是1990年Bottger發(fā)現某些Taq聚合酶被外源性DNA物質(zhì)污染。另外試驗中需要一定的特殊設備和熟練的操作技術(shù)，尚不能全自動(dòng)化，需要花勞力制備待檢樣品。

　　6．2．Qβ復制酶法

　　Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ復酶系統擴增法。這種命名是根據反應過(guò)程中起擴增作用的酶來(lái)確定的。通過(guò)探針與靶DNA相結合，系統以酶學(xué)方法促進(jìn)擴增。該探針是含有一個(gè)模板區域的RNA探針，其三級結構稱(chēng)作MDV1。系統含有RNA指導的RNA聚合酶、Qβ和復制酶。擴增MDV-1的速度很快。每循環(huán)一次需15-20秒，共循環(huán)15-30分鐘。千分之一含量的RNA可擴增到125-200ng，一億倍擴增。由于大量合成RNA，用簡(jiǎn)單的比色法就能檢測雜交反應。反應呈動(dòng)力學(xué)特征，建立標準曲線(xiàn)，確定初始結合物濃度，就可做定量分析。缺點(diǎn)是酶易受污染，導致敏感性下降，背景干擾限制了方法的實(shí)際應用。

　　6.3．連續擴增反應法（Lar）

　　Lar是在PCR基礎上的又一種改進(jìn)，同PCR不同之處在于它不擴增單個(gè)核苷酸形成DNA分子，而是用一種稱(chēng)作T4DNA連接酶把兩個(gè)寡核苷酸彼此相連。通過(guò)連接酶的作用，兩者能相互交聯(lián)，在這種情況下，同PCR反應一樣，連結的寡核苷酸沿原始系列排列，并成為下次循環(huán)的模板。循環(huán)20-30次可把原始靶DNA含量增加100萬(wàn)倍。但它需對整個(gè)靶DNA序列事先有明確了解，否則一個(gè)堿基錯配就會(huì )導致寡核苷酸相互連結的失敗。

　　6.4．轉錄放大系統（TAS/3SR/NASBA^TM）

　　1989年Kwoh等介紹了一種新技術(shù)，轉錄擴增系統（TAS），它是包括DNA合成和RNA轉錄的雙重循環(huán)過(guò)程。它以變性DNA和一般RNA為引物的寡核苷酸靶序列，這個(gè)寡核苷酸上包含多聚酶結合部和與靶序列互補配對的片段。雜交時(shí)，引物與靶序列結合，反轉錄酶延伸引物與靶序列互相配對，熱變性后，另外一個(gè)寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反轉錄酶產(chǎn)生與新股DNA互補的雙股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一個(gè)靶序列上。加入RNA聚合酶，可以擴增RNA的拷貝數（10-1000）。因此方法僅需4次循環(huán)就能得到RNA分子1,000,000個(gè)拷貝數。

　　1990年Gualelli修正了TAS法，設計了一種稱(chēng)作自我片段復制擴增系統（3SR）。3SR與TAS不同之處在于，3SR是等溫反應（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初變性這一步，3SR方法還是需要擴增DNA，RNaseH用于降解在TAS反應中形成的RNA-DNA雜合物，并轉化成雙股DNA。在雙股DNA的每一末端都含有一個(gè)聚合酶結合部，雙股DNA繼續循環(huán)并作為合成RNA的模板，再次參加反應過(guò)程。15分鐘就能放大100，000個(gè)拷貝。而PCR法即使有100%擴增效果也需要85分鐘才能取得同樣結果。

　　與PCR相比它不用熱循環(huán)，因此不必調節反應溫度，所有反應在一個(gè)反應管中完成。另外3SR能區分DNA和RNA，同其它擴增反應一樣，3SR易受外源核酸的污染。由于反應所需的酶多，并且與其它方法相比，反應嚴格性低，所以特異性較差。

　　1989年Cangene發(fā)明了核酸片段擴增法（NASBM^TM），此法已獲得歐洲專(zhuān)利。據報導它能將100個(gè)分子的DNA擴增到100ug。

　　6.5．放大信號檢測法

　　放大信號同時(shí)能改善DNA探針的敏感性。有些學(xué)者研究處用腺嘌呤酯標志DNA的生物化學(xué)檢測方法，反應初始時(shí)需加入H₂O₂，酯結構的破壞會(huì )產(chǎn)生光，光亮強度與存在的靶DNA含量成比例關(guān)系，也有人用一種稱(chēng)作磷酸苯二氧化物做生物發(fā)光劑，有報導稱(chēng)，此物質(zhì)在堿性磷酸酶作用下轉化為發(fā)光物質(zhì)，用比色法檢測它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介紹了用化學(xué)顯影學(xué)致敏劑作為標記物，加熱后，能釋放出光，用固相薄膜檢測能增加敏感性，生物化學(xué)發(fā)光法在DNA探針檢測上效果很好。

　　最近推崇非同位素的標記物是酶標抗體。標記抗體能與共價(jià)結合的DNA探針標記物相結合。如在探針尿嘧啶殘基上標記熒光素，再用高度親和力的辣根過(guò)氧化物酶標記抗熒光素抗體檢測原始探針。胞嘧啶磺化物或在鳥(niǎo)嘌呤上引入2-乙酰氨基熒光素及其衍生物也能替代熒光素和酶連結抗體。

　　另一種途徑是把非活性的S-肽從核糖核酸酶上連結到DNA探針上，雜交后，加入S-蛋白，可重新構建功能酶。再循環(huán)酶放大系統中檢測活化的核糖核酸酶。

　　現又研究出一種新方法，它是把探針切成兩半，每半標記兩種不同的能相互聯(lián)結的熒光物質(zhì)或酶系統成分中的一種。當兩種探針雜交相互靠近時(shí)，激活能量狀態(tài)的熒光物質(zhì)轉移到鄰近的熒光物質(zhì)或酶系統受體上，而激活受體產(chǎn)生信號。反應過(guò)程不用進(jìn)行分離，因為若沒(méi)有發(fā)生雜交反應，兩種成分不能相互靠近，不會(huì )產(chǎn)生檢測信號。

　　7.分子生物學(xué)技術(shù)在食源性病原菌檢測上的應用：

　　7.1.沙門(mén)氏菌

　　食品中沙門(mén)氏菌污染量小，常受應激損傷，不易恢復，現用檢測方法得到陰性報告最少需四天，陽(yáng)性報告還要延遲2-3天。研究檢測沙門(mén)氏菌的探針難度大，因為它擁有2000多個(gè)血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子。Fillal等人從染色體序列和構建的質(zhì)粒文庫中分離到一個(gè)適用于沙門(mén)氏菌檢測的探針。它能和沙門(mén)氏菌而不和其他微生物及樣品培養基發(fā)生非特異性反應。這種用同位素標記的探針，能識別350株不同的沙門(mén)氏菌。由于該方法最小檢出量只有1個(gè)細菌/25克樣品，所以需要增菌培養。

　　AOAC最近認可了Gene-Tark沙門(mén)氏菌比色分析法。這種探針標記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過(guò)氧化酶標記抗FITC的抗體結合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門(mén)氏菌的特異性檢出率為100%，假陽(yáng)性率為0.8%（BAM/AOAC培養法假陽(yáng)性率是2.2%。）

　　7.2李斯特桿菌

　　1981年首次確定它是一種食源性病原菌，1985年加尼福利亞發(fā)生爆發(fā)性流行，現用檢測方法大多采用冷增菌，費時(shí)費力。

　　FDA于1987年最新研制出針對李斯特菌致病基因β-溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測李斯特菌的DNA探針，它能特異性識別細菌的16SrRNA。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測樣品需先在LEB中培養16-22h，然后侵染比色檢測，假陰性率為0.8-4.7%（常規法為1.4-2.9%。）

　　1989年Bessesea等運用擴增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法檢測單核細胞增生型李斯特菌，DNA檢測量低于25ng，即少于1000個(gè)菌體，特異性強，能檢測出50株不同的單核李斯特菌，而不與12株非單核李斯特菌和12種非李斯特菌屬的細菌發(fā)生反應。

　　7.3.弧菌

　　關(guān)于用DNA探針檢測溶血性弧菌中溶血基因的報導很多。國外對DNA探針和單克隆抗體法在檢測鞭毛抗原方面作了比較，結果發(fā)現DNA探針?lè )��?yáng)性檢出率高。近年來(lái)用PCR擴增DNA片段，再做探針檢測，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測敏感性為10個(gè)細菌/克，但要用凝膠電泳進(jìn)一步鑒定。因此，不太合適檢測食品。1989年Olive構建了一個(gè)熱穩定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測付溶血弧菌。

　　7.4.志賀氏菌

　　目前志賀氏菌檢測方法存在著(zhù)質(zhì)粒容易丟失和受內源菌干擾的問(wèn)題。用核酸探針檢測可克服上述缺陷�，F采用人工合成³²P標記的寡核苷酸探針在固定薄膜上做菌落雜交檢測志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC），也有人用PCR擴增技術(shù)檢測志賀氏菌和（EIEC）。PCR擴增前需將福氏痢疾菌擴增培養到10000個(gè)/ml，增菌后檢測需6-7小時(shí)才能得到結果。敏感性為≤1個(gè)細菌/克。但PCR擴增后需做凝膠電泳進(jìn)一步鑒定，對常規檢測來(lái)講太繁瑣。

　　7.5．耶爾森氏菌

　　Hill等研制出針對同耶爾森氏菌侵襲性質(zhì)粒有關(guān)的DNA探針。用菌落雜交法對人工污染食品所做試驗敏感性明顯地受內源菌的影響。近年來(lái)，有人人工合成了一個(gè)24bp的寡核苷酸探針。它是針對侵襲性質(zhì)粒DNA中一部分的探針，用它檢測各種食品中耶爾森氏菌，發(fā)現，盡管無(wú)法區分無(wú)毒菌株且檢測限量不理想，但能檢測出10000－100000個(gè)細菌/克樣品。樣品中內源性細菌對試驗方法沒(méi)干擾。1989年Feng.P等研制針對由染色體編碼的耶爾森氏菌侵襲性基因的DNA探針。

　　7.6.彎曲桿菌

　　檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標記的。標記物為發(fā)光素。靶順序為rRNA。近來(lái)用堿性磷酸酶標記人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為100000個(gè)菌落形成單位（CFU），敏感性和特異性達100%。

　　探針對空腸彎曲桿菌的最低檢測量為20000至800000個(gè)活菌。由于糞便成分復雜，影響敏感性，此方法只在臨床檢測中應用，尚未用于食品檢測。

　　7.7.葡萄球菌

　　大多數檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關(guān)的基因序列雜交，這類(lèi)探針能檢測腸毒素A、B、C和E。

　　最近，GeneTark推出檢測金黃色葡萄球菌的探針，能半定量樣品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的認可。方法采用侵染棒比色法，探針檢測的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假陽(yáng)性率為9.3%，人工污染樣品中沒(méi)有假陽(yáng)性結果發(fā)生。

　　7.8.假單胞菌屬

　　亦已研制出能檢測從肉品中分離到的DNA基因序列相似的假單胞菌的DNA探針。

　　7.9.大腸桿菌

　　大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Gene-Tark研制出用侵染棒檢測大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標記探針，再用辣根過(guò)氧化物酶標記抗FITC抗體檢測雜交復合物。Hsu等報導方法特異性（除相近的志賀氏菌外）達100%，假陽(yáng)性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）。

　　七十年代人們認識到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作為糞便污染的指示菌。用DNA探針檢測大腸桿菌腸毒素于1984年得到AOAC的認可。近來(lái)研究出用PCR法檢測不耐熱腸毒素的方法，它可以編碼不耐熱腸毒素基因序列為引物，用PCR法擴增相應的DNA片段，不擴增耐熱腸毒素基因。檢測量為20個(gè)E.coli/100ul。Sander等構建了一個(gè)能檢測產(chǎn)生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大腸桿菌GUD（β-葡萄糖醛酸酶）基因的探針，GUD是AOAC認可的MUG（4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸），試驗中檢測的酶，現用PCR法擴增GUD基因，再用DNA探針雜交。MUG試驗（即MUG在GUD作用下釋放出4-甲基-7-羥香豆素，它在長(cháng)波紫外光照射下產(chǎn)生蘭色熒光）存在的問(wèn)題是大腸桿菌中發(fā)現有MUG陰性分離物，包括大腸桿菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探針證實(shí)GUD基因存在于所有大腸桿菌，包括O157：H7和志賀氏菌菌株中。MUG陰性菌株是由于GUD活性受到分解代謝產(chǎn)物的抑制。Kaspar等報導GUD抗體能和3/4MUG陰性菌株的提取物反應。這表明某些菌株是能產(chǎn)生GUD的，但沒(méi)有活性，這可能是因為底物無(wú)法進(jìn)入某些菌株細胞內或產(chǎn)物（4-甲基-7-羥香豆素）不能釋放到外界中。因此使用GUD探針檢測E.coli比MUG試驗準確。

　　7.10.病毒

　　每年因病毒引起的食物中毒約占2-12%，如1982年Norwalk病毒引起美國5000人患腸胃炎，此外凸隆病毒、柯薩奇病毒、萼狀病毒和細小病毒也都能引起爆發(fā)性腸胃炎。很久以來(lái)人們就發(fā)現食品中存在致病性病毒，但對它們的檢測方法報導甚少。

　　食品中病毒檢測與臨床病毒檢測不同。因為每克糞樣中約含幾千萬(wàn)個(gè)病毒粒子，而食品中僅有一個(gè)病毒粒子就會(huì )引起疾病。盡管如此，要造成對人的危害，尚需攝入成千上萬(wàn)的病毒粒子。為保證人類(lèi)健康，更精確評價(jià)病毒污染食品的程度，只有用DNA探針技術(shù)才能實(shí)現這一目的。

　　對市售食品中病毒種類(lèi)尚缺乏足夠的研究，大部分學(xué)者只注重對腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究，其它病毒因方法問(wèn)題尚未詳細報導。即便食品中含有病毒，由于它們數量少，難以從樣品中分離和在細胞上復制，實(shí)際上低估了食品中病毒的種類(lèi)。目前的檢測方法，需要把病毒沉淀，在細胞和動(dòng)物上復制驗證。DNA探針技術(shù)已用于檢測凸隆病毒、腺病毒和細小病毒，但還沒(méi)有用在食品檢測上。很難獲得足夠數量的病毒粒子大大限制了DNA探針技術(shù)在檢測病毒上的應用�？瞻唠s交技術(shù)缺乏足夠的敏感性，而且需事先用PCR擴增DNA片段，它只能用于檢測純培養的病毒。

　　FDA用合成的DNA探針檢測因食用貝類(lèi)食品引起腸炎患者糞樣中的細小病毒，還用DNA探測環(huán)境樣品中的甲肝病毒。但尚未發(fā)現用探針檢測Norwalk病毒的報導。

　　近年來(lái)，隨著(zhù)計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，對病原微生物的鑒定技術(shù)朝著(zhù)微量化、系列化、自動(dòng)化的方向發(fā)展，從而開(kāi)辟了微生物檢測與鑒定的新領(lǐng)域。最有代表性的是AMS微生物自動(dòng)分析系統。

　　AMS為美國VITEK廠(chǎng)產(chǎn)品，屬于自動(dòng)化程度高的儀器，由7個(gè)部件組成應用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進(jìn)行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。

　　操作時(shí)，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數功能的孵箱內，每隔一定時(shí)間，儀器會(huì )自動(dòng)檢測培養基的發(fā)酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結果。

　　該套系統檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應指標，基本同常規檢測鑒定，檢測所需時(shí)間4-8小時(shí)，最長(cháng)不超過(guò)20小時(shí)。