培養基手冊2005——1

體外培養（in vitro culture）包括：組織培養（tissue culture）、細胞培養（cell culture）、器官培養（organ culture）。顧名思義，就是將活體結構成分（如活體組織、活體細胞或者活體器官等）從體內或其寄生體內取出，放在類(lèi)似于體內生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長(cháng)發(fā)育的方法。廣義組織培養與體外培養同義。

體外培養已經(jīng)歷了約一百年的發(fā)展歷史，但發(fā)展初期進(jìn)程比較緩慢，沒(méi)有引起很多學(xué)者的重視。直到上世紀50年代后期，體外培養技術(shù)才廣泛應用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，使這項技術(shù)得到飛速發(fā)展�，F在體外培養已成為細胞工程、基因工程、抗體工程的重要組成部分。

細胞培養指從生物機體取出部分組織分散成單個(gè)細胞或直接從機體取出單個(gè)細胞，也可把體外培養細胞分散成單個(gè)細胞在體外條件下培養，細胞能繼續存活與增殖。培養過(guò)程中細胞不再形成組織。

發(fā)展與完善細胞培養技術(shù)圍繞防止污染、改進(jìn)培養方法、設計新型培養容器、設計不同的培養液等幾個(gè)方面進(jìn)行。

1885年Roux溫生理鹽水培育雞胚組織；

1903年Jolly，1906年Beebe等發(fā)明了蓋片懸滴培養；

1907年Harrison培養蛙胚神經(jīng)成功，開(kāi)始創(chuàng )建蓋片凹玻璃懸滴培養法；
1910、1912年Carrel采用無(wú)菌操作、更新培養基、傳代，完善了懸滴培養法；
1924年Maximow采用雙蓋片懸滴培養法；
1923年Carral設計創(chuàng )立了卡氏瓶培養法，用此法可根據需要隨時(shí)更換培養液，既有利于組織不斷生長(cháng)，又可以運用不同種類(lèi)的營(yíng)養液培養不同的細胞，極大地推動(dòng)了當時(shí)組織培養研究。

Earle等加以改進(jìn)，使大量細胞能直接生長(cháng)于玻璃瓶壁上，培養了正常細胞與腫瘤細胞的細胞株。至此大多數研究人員都采用培養瓶培養細胞。

組織培養從二十世紀40年代起迅速發(fā)展,在培養容器、培養基和培養技術(shù)等方面出現了很多革新。

在培養容器方面, 由簡(jiǎn)單的用試管、旋轉管培養，發(fā)展到多種培養瓶培養，近年來(lái)，塑料瓶、皿、多孔培養板的使用已日趨普遍。

在培養基方面，從50年代初，Parke、Eagle等設計出合成培養基后，從純天然培養基到合成培養基、從雞胚浸出液發(fā)展到動(dòng)物血清（促細胞生長(cháng)物），直至60年代設計出無(wú)血清培養基。

首先反映在設計不同種類(lèi)的緩沖鹽溶液，以用來(lái)培養不同的細胞和洗滌細胞。Earle在1948年設計了含有碳酸氫鈉等鹽類(lèi)的Earle氏鹽溶液，Hank’s在1949年設計了Hank’s氏鹽溶液。

在培養技術(shù)方法方面，革新進(jìn)展更為迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年創(chuàng )建單層細胞培養法，首建長(cháng)期傳代的L-細胞系。
　　1948年Sanford創(chuàng )建單細胞分離培養法，獲L-細胞純系。
　　1951年Gey首建人腫瘤細胞——Hela細胞系。
　　1961年Hayflick首建人二倍體細胞系25種，開(kāi)辟了應用新方向。
　　從50年代末開(kāi)始，組織培養技術(shù)應用進(jìn)入了一個(gè)繁盛的階段，廣泛應用于生物學(xué)和醫學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。
　　誘變建立遺傳缺陷細胞株、雜交瘤技術(shù)制備單抗、發(fā)展細胞大量培養技術(shù)、利用重組技術(shù)構建工程細胞株，已成為生物工程的重要生產(chǎn)手段。

在連續灌注培養工藝方面，美國Ohashi,Ryo等人2001年報道采用2L一次性生物反應器灌注培養雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68為培養基，最高活細胞密度超過(guò)1×10⁷cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用帶超聲細胞分離器(UCS)的連續灌注攪拌罐生物反應器培養鼠雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體，穩態(tài)培養時(shí)活細胞密度超過(guò)2×10⁷cells/ml；2004年德國Thomas等人在1L攪拌罐生物反應器中培養rCHO細胞生產(chǎn)人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖濃度限制的高產(chǎn)率灌注工藝減少有害代謝物，代謝轉向TCA循環(huán)增加，活細胞密度保持在(1～2)×10⁷cells/ml。

在流加懸浮培養工藝方面，美國麻省理工Xie Liangzhi等人2000年報道在2L生物反應器中流加培養雜交瘤細胞，通過(guò)營(yíng)養控制降低氨和乳酸的比生成速率，補充培養基包括營(yíng)養成分、胎牛血清和痕量金屬，最大活細胞密度達到1.7×10⁷cells/mL。

1．科學(xué)研究

（1）藥物研究開(kāi)發(fā)，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細胞工程藥物 

研究與開(kāi)發(fā)、單克隆抗體制備等。

（2）基礎研究，如藥物作用機理、基因功能、疾病發(fā)生機理等研究。

2．生物制藥

（1）疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫

苗（腫瘤疫苗)等。

（2）基因工程藥物生產(chǎn)：如EPO等。
（3）抗體藥物、基因治療藥物生產(chǎn)。
（4）細胞工程藥物生產(chǎn)：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等。

（5）利用細胞法體外測定生物活性物質(zhì)的活性；并預測其在體內的藥效和替代體內法檢測其成品的生物活性。

人工模擬細胞體內生長(cháng)的營(yíng)養環(huán)境，維持細胞生長(cháng)的營(yíng)養物質(zhì),它是提供細胞營(yíng)養和促進(jìn)細胞生長(cháng)增殖的物質(zhì)基礎。包括：

1．天然培養基

指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一些培養基，如動(dòng)物血漿、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。

2．合成培養基

人工設計、配制的培養基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。

 

動(dòng)物細胞大規模培養已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并以其研究的深入和進(jìn)展推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專(zhuān)家預言：蛋白治療藥物如糖蛋白、抗體和多肽藥物僅僅只是剛剛開(kāi)始進(jìn)入市場(chǎng)，預計在下一個(gè)10年或20年會(huì )有更為快速的發(fā)展。屆時(shí)，蛋白治療藥物的迅速增長(cháng)和市場(chǎng)需求將遠遠超過(guò)全世界的生產(chǎn)能力。

動(dòng)物細胞規�；�生產(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當前較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時(shí)間，加快工業(yè)化進(jìn)程。當前已獲FDA批準的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開(kāi)發(fā)表的生產(chǎn)工藝中，占有主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應器懸浮培養，工藝設計是流加或灌注培養。其大規模細胞培養生產(chǎn)所面臨的挑戰是獲得最大生產(chǎn)力的同時(shí)注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量；去除所有培養環(huán)境中外源因子的污染；更為精確有效的工藝控制手段；規�；�培養中氧氣的限定與溶解CO₂濃度累積的控制等。 

1996年1月至2002年12月美國獲得成功批準的不同的治療劑和診斷劑產(chǎn)品共31種，其中用哺乳動(dòng)物細胞培養生產(chǎn)的就有21種。動(dòng)物細胞培養技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)受到普遍信任的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，并逐步形成商業(yè)化操作水平。

動(dòng)物細胞大規模培養技術(shù)集中在細胞系、細胞培養基和細胞生物反應容器三個(gè)方面，構成生物制品生產(chǎn)的必要條件。

其中細胞是病毒、蛋白的表達載體，細胞質(zhì)量直接影響蛋白的表達量或病毒的滴度，故篩選、馴化優(yōu)質(zhì)細胞是關(guān)鍵。而只有好的細胞培養基才可能篩選、馴化出優(yōu)質(zhì)的細胞。

細胞生物反應容器也在不斷發(fā)展，以轉瓶、反應器為主要細胞生產(chǎn)設備，配合高密度培養、微載體培養、懸浮培養技術(shù)，均需要相適應的細胞培養基以充分發(fā)揮作用,獲得高表達、高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

 

        細胞培養技術(shù)對生物制品成本的影響

1．表達量提高

通過(guò)細胞培養技術(shù)的不斷改進(jìn)可以充分利用現有設備，大幅度提高生物制品表達量，降低生物制品的單位制造成本；同時(shí)，由于產(chǎn)量提高并不新增固定資產(chǎn)投資，也帶來(lái)生物制品的單位固定成本的降低。

因此提高表達量可以有效降低生物制品的單位成本，既降低變動(dòng)成本，也降低固定成本，使得制品利潤率提高，市場(chǎng)競爭能力增強。

2．培養液成本降低

在很多使用牛血清的細胞培養液中，為牛血清支付的成本遠遠高于培養液中的細胞培養基等其它成分，因此通過(guò)采用低血清細胞培養基，降低牛血清用量，可以降低細胞培養液總成本。

3．純化成本低，制品安全性提高

牛血清的使用量不僅增加了細胞培養液的成本，更嚴重的是帶來(lái)動(dòng)物來(lái)源成分、雜蛋白，以及不安全因素，這些成分越多，純化的成本越高、生物制品原液損失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、無(wú)血清培養細胞可以有效降低純化成本何損失，提高生物制品成品率和利潤率。

4．綜合成本降低

綜上所述，動(dòng)物細胞培養技術(shù)是生物制品產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)之一，在生產(chǎn)中，應該系統、全面的研究細胞培養技術(shù)對生物制品成本的綜合影響，不斷追求最佳的細胞培養技術(shù)，提高生產(chǎn)效率，有效降低生物制品成本，提高利潤率，增強產(chǎn)品市場(chǎng)競爭力。

1．基本營(yíng)養物質(zhì)

（1）    糖

六碳糖主要能源、維持滲透壓，含葡萄糖1-5%。

（2）    氨基酸

維持生存需12種氨基酸（精、胱、亮、異亮、賴(lài)、蛋、苯丙、蘇、色、組、酪、纈）。谷氨酰胺需量最大,缺乏時(shí)細胞生長(cháng)不良。

單細胞培養或細胞量少時(shí),所需氨基酸的種類(lèi)和量增多，細胞主要利用左旋氨基酸異構體。

（3）    維生素

細胞大部分需水溶性B族維生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促進(jìn)正常細胞生長(cháng)繁殖。

2．促生長(cháng)因子、激素類(lèi)物質(zhì)

3．其它物質(zhì)

基本元素、微量元素、促細胞貼附物質(zhì)(纖粘連蛋白、層粘連蛋白laminin、IV型膠原、氨基多糖類(lèi))

4．水

主要成分和生存環(huán)境,要求高純度水。

5．溫度

哺乳動(dòng)物及人源細胞最適培養溫度為35℃—37℃,對低溫耐受力比高溫強。39℃以上受損→死亡；不低于0℃時(shí)（0℃-34℃），細胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。

6．氣體環(huán)境和pH

需O₂、CO₂，通氧量過(guò)大對細胞有毒害。

CO₂主要與維持pH有關(guān)，細胞培養最佳pH為7.2—7.4，通過(guò)緩沖系統和調節CO₂含量，維持正常pH。

開(kāi)放培養要求5%CO₂環(huán)境、HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH變化。

含Earle’s緩沖系統的培養基適合于5％CO₂的培養條件，Hanks’緩沖系統的培養基僅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用于5％CO₂的環(huán)境，若放入CO₂培養箱，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應注意。

7．濕度和光

開(kāi)放培養相對濕度控制在95%。細胞培養需避光，紫外線(xiàn)或可見(jiàn)光可造成核黃素、酪氨酸、色氨酸等產(chǎn)生有毒的光產(chǎn)物，抑制細胞生長(cháng)，降低其貼壁能力。

8．影響細胞生長(cháng)的其它因素

接觸橡膠用品、收集細胞時(shí)離心速度過(guò)大、細胞接種濃度過(guò)低等。