反硝化細菌的篩選及培養條件的研究

微生物在自然界氮素循環(huán)中起著(zhù)重要作用，如固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用( denitrification ) 。其中，硝化作用與反硝化作用維持自然界氨的平衡及氮的正常循環(huán)。 氨化作用由氨化細菌或真菌的作用將 有機氮分解成為氨與氨化合物， 硝化作用由亞硝酸鹽 細菌和硝酸鹽細菌將氨化合物氧化為亞硝酸鹽和硝 酸鹽；反硝化作用也稱(chēng)脫氮作用，由微生物在厭氧或 微厭氧條件下將硝酸鹽還原成氧化亞氮或氮氣。反硝化作用對于控制水體富營(yíng)養化，處理污水和凈化水域有著(zhù)極大的利用價(jià)值。目前已發(fā)現某些植物、真菌和細菌都具有反硝化作用。已知有50以上的微生物 能夠進(jìn)行反硝化作用 ，其中絕大多數是細菌。 

 

反硝化細菌 ( denitrifying  bacteria )通過(guò)誘導產(chǎn)生硝酸還原酶和亞硝酸還原酶對硝酸鹽和亞硝酸鹽進(jìn)行還原。不同反硝化細菌的反硝化作用能力不同，生長(cháng)條件也存在很大差異。作者從玉溪紅塔集團技術(shù)中心生理生化實(shí)驗室篩選出的45株具有反硝化作用的細菌菌株中， 進(jìn)一步篩選具有較強反硝化作用能力的菌株，并對目的菌株的最適培養基、生長(cháng)溫度及好氣性進(jìn)行測定 ，為反硝化細菌的利用提供依據。 

l 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及來(lái)源

反硝化細菌菌株： B11 ， B15 ， B20 ， B27 ， B28 ， B67 ，B88，B112，B115，B118，B121，B132，B135，B223，B224，B226，B237，B241，B246，B248，B249，B260，B289，B290，B291，B292，B294，B295，B296，B297，B298，B299，B300，B310，B311，B315，B316，B318，B319 ， B320 ， B322 ， B323 ， B329 ， B330 ， B419 。由玉溪紅塔集團技術(shù)中心生理生化實(shí)驗室提供。 

1.1.2培養基及制備

1.1.2.1斜面培養基

牛肉浸膏蛋白胨培養基。 

1.1.2.2  Giltay培養基

A溶液 ： KNO₃ 1.0g ，天冬酰胺1.0 g ，1％BTB酒精溶液5 mL ，蒸餾水500 mL 。

B溶液： 檸檬酸鈉8.5 g ，MgSO₄· 7 H ₂O 1.0g ， F e Cl₃·6 H ₂ O 0.05g ， KH ₂ PO₄  1.0g ， CaC1₂· 2 H ₂O 0.2g ， 蒸餾水500 mL 。

混合A、 B兩溶液調節 p H值為7.0～ 7.2 ， 分別裝入 250 mL三角瓶，每瓶150 mL， 滅菌備用。 

1.1.2.3待篩培養基

硝酸鹽培養基：牛肉浸膏3g ，蛋白胨5 g ，KNO₃ ( NaNO₃ ) 1 g ， 蒸餾水1000m L 。 

反硝化細菌培養基：KNO₃2 g ， MgSO₄·7 H₂O 0.2 g ，K₂HPO₄  0.5 g ，酒石酸鉀鈉20g ，蒸餾水1000 mL 。 

Y B培養基。

調節待篩培養基和YB培養基pH為7.2 ，分別裝入250 mL三角瓶， 每瓶150 mL， 滅菌備用。 

1.1.3儀器與器材

自動(dòng)化學(xué)分析儀， CO₂ 培養箱，血球計數板，搖床。 

1.2方法

1.2.1菌株反硝化作用能力的測定

1.2.1.1產(chǎn)氣特性測定

參考Giltay方法測定反硝化作用菌株的產(chǎn)氣特性 ： 

將制備的 Giltay液體培養基，加入大試管 ( 20mm×200 mm)中，把纏有細線(xiàn)的小試管 ( 12 mm×75mm ) 倒立放入大試管中，將小試管中的氣體排凈，塞住大試管，留部分細線(xiàn)在大試管外，便于小試管的提升和降落，滅菌備用。

用 Giltay液體培養基2 mL洗下活化后的菌株， 轉入盛有小試管和 Gi l t a y液體培養基的大試管中，將小試管提升一段距離，以便接收氣體，接種時(shí)注意不要使小試管內進(jìn)入氣體。每個(gè)菌株接4支試管，3 0℃ 恒溫培養 1 0～1 4 d ， 觀(guān)察結果。重復 3次。 

1.2.1.2硝酸鹽降解能力的測定

將產(chǎn)氣試管內的培養基濾紙過(guò)濾，取濾液，用蒸餾水稀釋100倍 ，以自動(dòng)化學(xué)分析儀檢測培養基中的含氮量，測定菌株的反硝化作用能力，重復3次。 以滅菌后的培養基作為對照。 

1.2.2菌株適宜培養基及好氣性測定

將篩選出的菌株在斜面上3 0℃培養1 d后，用10m L無(wú)菌水洗下，振蕩混勻。分別轉接1mL洗下的菌液于滅菌的硝酸鹽培養基、反硝化細菌選培養基和 YB培養基中。每個(gè)處理都分別在搖床和CO₂培養箱( CO₂濃度為20％) 中，30℃振蕩培養1d。稀釋平板法測定篩選菌株的最適培養基及好氣性。重復 3次。 

1.2.3生長(cháng)溫度的測定

設20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等 5種溫度梯度，30℃YB培養基培養1 d ，稀釋平板法測定菌株生長(cháng)的最適溫度。 

1.2.4菌體濃度的測定

設18、21、24、27、30、33 h等7個(gè)時(shí)間梯度，30℃YB培養基培養，用血球計數法測定所篩菌株在最適 生長(cháng)條件下菌體的最高濃度。 

2 結果與分析

2.1菌株反硝化作用強度的篩選

2.1.1產(chǎn)氣測定

在接種B88、B237菌株的試管內，2d后培養基開(kāi)始變藍，并有少量氣體產(chǎn)生，滯留在小試管中；3d后培養基由綠色變?yōu)樗{色，小試管內的氣體明顯增多；接種3～4 d后，產(chǎn)氣的速度最快，氣體量最多，以后幾天則看不出氣體量的增加。接種其他菌株的試管內，培養基顏色由上向下逐漸變藍 ，但不產(chǎn)氣。

利用Giltay培養基法篩選菌株，試管中的培養基由于反硝化細菌硝酸還原酶的作用 ， 硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使培養基呈堿性，培養基顏色由綠色變?yōu)樗{色。反硝化作用較強的菌株通過(guò)亞硝酸還原酶的作用，亞硝酸鹽進(jìn)一步還原成氧化亞氮或氮氣， 滯留在小試管中。在45個(gè)供試菌株中， B88和 B237菌株能夠較好地降解培養基中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，產(chǎn)氣早，速度快，3～4 d產(chǎn)氣達到高峰，表明其反硝化作用較強。其他菌株雖然也都能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，但不能進(jìn)一步還原亞硝酸鹽，反硝化作用較弱。

2.1.2菌株降解硝酸鹽特性的測定在接種B88 、B237的培養基中，含氮量明顯降低，表明 B88 、 B237菌株具有較強的反硝化作用，能夠有效降解培養基中的硝酸鹽 ，見(jiàn)表 1 。 

表 1 菌株反硝化作用效果測定( r=0.99921 ， 100 m g·L^-1  ) 

2.2培養基及好氣性測定

由于反硝化細菌是在厭氧或微厭氧的條件下通過(guò)硝酸鹽誘導產(chǎn)生的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶進(jìn)行反硝化作用，因此，大多數研究人員在實(shí)驗室培養反硝化細菌時(shí)，多在微厭氧條件下進(jìn)行。但本試驗結果表明，不管有無(wú)硝酸鹽的誘導，B88、B237菌株的快速生長(cháng)是好氣性的，生長(cháng)受氧氣供應量的限制，CO₂含量 (20％)的提高，對菌株的生長(cháng)具有較強抑制作用； 在不同培養基上，其生長(cháng)速度差別較大；在反硝化細菌培養基上生長(cháng)速度反而慢 ， 而在 Y B培養基中的 生長(cháng)速度快，表2 、表 3 。 

表 2 在恒溫箱、 CO₂培養箱內不同培養基對B 8 8菌株生長(cháng)的影響

 

表 2 在恒溫箱、 CO₂培養箱內不同培養基對B237菌株生長(cháng)的影響

 

2 ． 3生長(cháng)溫度測定

溫度對B88、B237菌株的生長(cháng)速度有顯著(zhù)影響， 在好氣條件下，用YB培養基振蕩培養，菌株在20℃～40℃之間均能較好地生長(cháng)，3 0℃左右為最適生長(cháng)溫度。 

2.4生長(cháng)濃度的測定

反硝化細菌經(jīng)過(guò)緩慢增長(cháng)期和指數增長(cháng)期后，由于營(yíng)養的消耗和細菌之間的抑制作用， 菌體衰老、 消解，細菌濃度逐漸降低。B88菌株在最適培養條件下最高生長(cháng)濃度為6.1×1 0   個(gè)·mL^-1，B237菌株在最適培養條件下最高生長(cháng)濃度為1.54×10⁸個(gè)· mL^-1  。 

3 結論與討論

反硝化細菌主要應用于工業(yè)廢水或污染河流、池塘的水處理，降低水中的有害含氮物質(zhì)， 改善水質(zhì)。反硝化細菌的培養，一般采用專(zhuān)用的反硝化細菌培養基。但不同的反硝化細菌好氣性不同、并且不同碳源、pH值、溫度、培養基成分對反硝化細菌的生長(cháng)有很大影響。在常用的反硝化細菌培養基中，篩選最適生長(cháng)的培養基，對于細菌的富集培養及工業(yè)應用具有重 要意義。 

常規 Giltay培養基法篩選反硝化細菌使用規格為15 mm×150 mm的試管和杜哈姆管，這樣滯留在杜哈姆管的氣體量少，也不容易收集。本試驗用20 mm×200 mm的大試管，用 12 mm×75 m m的小試管代替杜哈姆管，并將小試管用細線(xiàn)纏繞懸掛，有利于滯留更多的氣體，并且容易收集，也更有利于對氣體成分進(jìn)行檢測。采用常規方法，從4 5株反硝化細菌中篩選出 B88 、 B237兩株反硝化作用較強的菌株，從幾種常用的反硝化細菌培養基中篩選出適合菌株生長(cháng)的 YB 培養基，并確定菌株最適生長(cháng)溫度為3 0℃ ，以及菌株在Y B培養基中生長(cháng)的最高濃度：B 8 8為6.1 ×10⁸個(gè)·mL^-1  ； B237為 1.54×10⁸ 個(gè) · mL^-1 。

 B88 、B237菌株的鑒定及其在工業(yè)上應用有待于進(jìn)一步研究。