國產(chǎn)MH瓊脂質(zhì)量控制的探討

MH瓊脂( M u l l e r   H i n t o n   A g a r ) 是至今被國際公認和 WHO推薦的最適用于瓊脂紙片擴散法 ( K i r b y--B a n e r 紙片擴散法) 測定細菌對抗生素敏感性的培養基。究其原因，主要由于MH瓊脂培養基產(chǎn)品批間藥物敏感試驗重復性比其他培養基好；接種于 MH瓊脂培養基上， 絕大多數致病菌生長(cháng)良好；MH瓊脂培養基對磺胺、甲氧芐胺嘧啶、四環(huán)素的抑制成分含量低。國內外有關(guān)藥物敏感試驗的大量數據是由 M H瓊脂作為培養基試驗得出的。 

1   國產(chǎn)MH瓊脂培養基作為藥敏試驗培養基使用存在的主要問(wèn)題

1.1 批間產(chǎn)品的穩定性

國產(chǎn)MH瓊脂培養基批間產(chǎn)品穩定性不夠，主要是MH瓊脂中主要原料的質(zhì)量不穩定性造成的：①酸水解酪蛋白( C a s e i n  Hydrolysate ) ，水解工藝的不穩定性。②牛肉浸出粉( Beef ， Dehydrated  infusion From) ，混有經(jīng)酶消化的牛肉膏粉。③瓊脂，去除游離的礦物質(zhì)，才能保證藥敏試驗的結果。瓊脂的凝膠強度及在培養基中的濃度均能影響藥物的擴散 。④培養基堿性增加能擴大氨基糖苷類(lèi)藥物的抑菌圈。酸性增加能擴大四環(huán)素的抑菌圈。MH瓊脂一般pH為7.2～ 7.4，接近人體體液的p H值。

1 .2 拮抗物質(zhì)

MH瓊脂原料中存在過(guò)量的被測藥物的拮抗物質(zhì)：① 胸腺嘧啶核苷( Thymidine )胸腺嘧啶( Thymine ) 抑制磺胺類(lèi)藥和甲氧芐胺嘧啶的活力。胸腺嘧啶核苷對TMP的抑制是胸腺嘧啶的10倍。② MH瓊脂中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷水平是否足夠低， 是否在合格范圍內， 美國國立臨床實(shí)驗室標準委員會(huì )( NCCLS ) 規定可用 TMP—SMZ紙片鑒定，它對糞腸球菌 ATCC 29212的抑菌圈直徑應 ≥2 0 m m， 且邊緣清晰，這是檢測 MH瓊脂是否合格的標準之一( 表 1 ) 。 

 

表1 標準菌株在6種MH瓊脂上對TMP-SMZ的抑菌圈50次測試平均值和測試范圍（mm） 平均值用X表示

 

 

 

 

2 0 0 7年上海市疾控中心培養基室用 3株標準菌株在不同批次自配 M H瓊脂上對 T M P—S MZ進(jìn)行了抑菌圈測試，結果見(jiàn)表2 。自配 MH瓊脂對糞腸球菌 ATCC29212的平均抑菌圈為20.5 m m，表明原料中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的含量是基本合格的。3株標準菌株抑菌圈的變異系數( CV) 均小于5 ％， 表明國產(chǎn)自配MH瓊脂的穩定性還是可以的。 

表2   標準菌株在不同批次自配MH瓊脂上對TMP-SMZ的抑菌圈測試結果（mm）

 

 

1.3二價(jià)離子

Mg²⁺  、Ca²⁺在培養基中的濃度變化，影響四環(huán)素、多粘菌素、氨基糖苷類(lèi)藥物的抗菌活性。含量過(guò)高，使抑菌圈變��；含量過(guò)低，使抑菌圈變大。特別對銅綠假單胞菌的敏感性影響較大。一般認為，1000  mL培養基中Ca²⁺  50～200 mg ， Mg²⁺  20～35 mg較為適宜。Cu²⁺、 Zn²⁺ 、 Sn²⁺在培養基中只要微量存在，青霉素就會(huì )很快分解成青霉素噻唑酸而失去抗菌活性。SO₄^2- ，瓊脂中極易殘存此子， 其可與多粘菌素、新霉素等藥物發(fā)生化學(xué)反應， 從而影響藥物的擴散和抗菌活性  。 

1.4其他

氨基甲酸乙脂( Urethane )、葉酸、葡萄糖、某些蛋白胨和氨基酸對磺胺類(lèi)藥均有不等的拮抗作用。 

2 干擾 MH瓊脂質(zhì)量的外界因素

2.1藥敏紙片 

標準紙片直徑為1／4時(shí) ( 約6.35mm) ，重量為 ( 30± 4 ) mg／cm² ，吸水性為重量的2.5～ 3.0倍， pH= 7.0 ，無(wú)影響抗菌活性的二價(jià)離子�？股�素含量必須符合 NCCLS規定的濃度。長(cháng)期保存應置于 -2 0 ℃以下低溫冰箱。使用前應將使用量紙片置 0 ~ C預溫  。 

2.2 細菌接種量

細菌接種量是控制試驗重復性的主要因素。一般接種量是0.5麥氏單位的菌液約0.1mL 。加大菌量可使抑菌圈縮小， 反之能使抑菌圈擴大 。 

2.3 平皿制備與保存

9.0 c m平皿傾注培養基一般為 25～ 30 mL ， 15cm平皿為60 mL， 厚度均應達4mm。如大量配制應對產(chǎn)品抽樣，于3 0～ 35℃， 24 h作無(wú)菌試驗培養。平皿應置于密封塑料袋內放入冰箱， 2～7℃保存。有效期為7 d。 

2 .4 培養溫度和時(shí)間

最佳培養溫度為 35℃， 培養時(shí)間為16～18 h 。溫度偏低細菌所需生長(cháng)時(shí)間延長(cháng)，造成抑菌圈變大； 溫度超過(guò) 35℃， 可使某些抗生素如：苯唑青霉素、甲氧苯青霉素等失效。有學(xué)者發(fā)現，在35℃培養時(shí)，對甲氧苯青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌在 3 7 ℃時(shí)可不顯示耐藥  。 

3 推薦的 MH瓊脂質(zhì)控方法

3.1培養基制備

按干粉培養基說(shuō)明，正確稱(chēng)量和加蒸餾水或去離子水。煮沸溶解后，置 121℃ 15 mi n滅菌。冷至5 5℃左右， 傾注無(wú)菌平皿。9c m平皿約2 5～ 3 0 m L ，達到厚度4 m m。MH瓊脂最終 pH在 2 5 ℃應為7.2～ 7.4   。 

3.2 常用質(zhì)控菌株

糞腸球菌 AT C C   2 9 2 1 2； 大腸埃希菌 A T C C   2 5 9 2 2；

金黃色葡萄球菌 A T C C   2 5 9 2 3 ； 銅綠假單胞菌 A T C C   2 7 8 5 3 。 

3.3 質(zhì)控菌株的保存

短期保存 ，可用胰蛋白胨大豆瓊脂斜面 ，4～8 ℃保存， 每周傳代 1 次。長(cháng)期保存， 可將菌株置于合適的穩定性強的保菌培養基中( 如含50 ％胎牛血清或脫纖維羊血的胰蛋白胨大豆肉湯， 亦可用含 1 0 ％ ～1 5 ％甘油的胰蛋白胨大豆肉湯) ， 保存于 -2 0 ℃或更低溫度條件下 。另外，還可用真空凍干方法保存。每月至少用冷凍或凍干菌株更換一次質(zhì)控菌株。 

3.4 工作懸液制備

從 T S A平皿上挑取3～5個(gè)形態(tài)相似的菌落頂端部分接種 MHB或 T S B培養基。經(jīng) 3 5℃培養 4～ 6 h 后 ，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至標準比濁管相同濁度 ( 0.5麥氏單位即約 1.5×1 0⁸  C F U／m L ) �；蛴梅▏�生物梅里埃A T B比濁儀比濁至 0.5麥氏單位。標準比濁管的配方：0.04 mo L／L  BaC1 ₂( 1.175 ％ W／V  BaCl ₂   2 H₂O)0.5 m L，0.7 2 mol /L H₂SO₄ 99.5m L 。0.5麥氏濁度標準管質(zhì)控，應每月用分光光度計測吸光度，OD值應在0.08～ 0.1 0之間 。 

3.5 試驗步驟

將藥敏紙片、MH平皿從冰箱拿出，預溫至室溫。接種：用無(wú)菌棉拭浸取比濁好的菌液， 在管壁內輕輕轉壓除去過(guò)多菌液，然后再輕輕涂抹受檢和對照培養基，每一平皿涂抹3次。每次涂抹后均需將平皿轉動(dòng)6 0度，再行下一次涂抹。目的使細菌呈融合的菌苔生長(cháng)。每一質(zhì)控菌 株涂抹3只平皿 。貼片： 接種后的平皿置室溫片刻， 待稍干后 ，用無(wú)菌鑷子將抗生素紙片均勻貼布于平皿瓊脂表面。各紙片間中心間距不得 < 2 4mm ， 紙片距平皿邊不得 < 1 5 min 。一旦紙片接觸瓊脂表面，即不可再移動(dòng)，因此時(shí)藥物已開(kāi)始擴散。應在15 m i n內完成藥敏紙片的放置。培養 ， 紙片貼妥后，在 15～ 3 0 m i n內，將平皿翻過(guò)來(lái) 置于3 5℃ 培養 1 6～1 8 h后， 觀(guān)察結果。平皿培養時(shí)不宜堆放 ， 以2個(gè)相疊為宜  。觀(guān)察結果，在反射光下，用精確至 1／ 1 0 mm的卡尺測量抑菌圈。MH瓊脂質(zhì)控參考標準見(jiàn)表 3 。 

表3   MH瓊脂質(zhì)控參考標準