豬鏈球菌分離鑒定及藥敏試驗

    豬鏈球菌是一種人畜共患的傳染性疾病，有 I、 I I 兩個(gè)型， 其中I I 型最多見(jiàn)，可致豬腦膜炎、關(guān)節炎、肺炎、心內膜炎、多發(fā)性漿膜炎、流產(chǎn)和局部膿腫。本菌主要通過(guò)創(chuàng )口感染人，引起人鏈球菌中毒性休克綜合征( STSS ) 和鏈球菌腦膜炎綜合征( SMS ) ，給養豬業(yè)及公共衛生構成了嚴重的威脅。2007年春，吉林省某豬場(chǎng)豬群相繼發(fā)生了一種以高熱、 跛行、神經(jīng)癥狀為特征，致死率極高的急性敗血性傳染病，筆者采集了病、死豬病料分離到 1株細菌，通過(guò)培養特性、菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、染色特性、生化試驗、血清學(xué)試驗、菌體脂肪酸分析、動(dòng)物致病性試驗等系統鑒定，確定為豬鏈球菌I I 型。并經(jīng)藥物敏感試驗，采取措施控制了疫情，現將結果報告如下。 

1 材料與方法

1.1病料來(lái)源

采自吉林省某豬場(chǎng)病死豬的病變肺臟、心血、腸系膜淋巴結、肝臟、心包液和病變關(guān)節液。 

1.2主要試劑及儀器

鮮血瓊脂、普通瓊脂、 麥康凱瓊脂、 半固體糖發(fā)酵培養基、 血清肉湯培養基、 匹克氏增菌液按常規方法制備。 豬鏈球菌 I I 型診斷血清購自荷蘭 DL O公司。質(zhì)控菌株ATCC49619、ATCC25922購自中國藥品生物制品鑒定所。青霉素鉀、鏈霉素、慶大霉素、頭孢拉定、復方新諾明、萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、利福平、紅霉素、 克林霉素和羅紅霉素等l3種藥敏紙片分別購自上海衛生技術(shù)服務(wù)公司生物試劑所和北京天壇藥物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。 

1.3實(shí)驗動(dòng)物

小白鼠、3 0日齡仔豬 ( 吉林農業(yè)大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供) 。 

1.4細菌的分離與鑒定

1.4.1細菌的分離  將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后無(wú)菌采取病料于鮮血瓊脂平板上劃線(xiàn)分離，3 7℃有氧條件培養24 h ， 可疑菌落接種于匹克氏增菌液， 3 7℃培養24 h ，挑取單個(gè)菌落經(jīng)涂片、染色、鏡檢，證實(shí)為純培養物，將其接種于鮮血瓊脂斜面上進(jìn)行培養，得到純培養物。 

1.4.2形態(tài)結構、 染色特性與運動(dòng)性檢查按常規方法進(jìn)行。   ． 

1.4.3培養特性試驗分離菌接種于血清肉湯、普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板等培養基中，3 7℃有氧條件下培養觀(guān)察其生長(cháng)表現。同時(shí)另一組置于厭氧罐中3 7℃培養觀(guān)察其生長(cháng)表現。 

1.4.4生化試驗 用分離菌純培養物進(jìn)行蔗糖、山梨醇、棉實(shí)糖、葡萄糖、甘露醇、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉試驗。 

1.4.5血清學(xué)試驗  玻片凝集試驗： 將純菌經(jīng)緩沖肉湯培養8 h ， 通過(guò)3 0 0 0 r ／mi n離心 1 0mi n ， PBS洗滌2次， 用pH7．2的0.0 1 mo l ／L  PBS 制成 1×10¹⁰  ～2×10¹⁰ 細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當的抗血清在潔凈玻片上混勻， 立即觀(guān)察凝集現象。 同時(shí)，設立細菌懸液對照及血清對照。 

1.4.6 動(dòng)物致病性試驗

1.4.6.1小白鼠感染試驗用5只2 0 g 左右重的小白鼠腹腔接種分離菌血清肉湯培養物0.2   mL ( 2×10⁷ C F U／ mL ) ，另設5只分別腹腔注射0.2 mL血清肉湯作對照。對注射后的小白鼠隔離飼養，觀(guān)察其發(fā)病及死亡情況，對死亡的立即解剖，無(wú)菌采取肝臟、脾臟病料，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。并在鮮血瓊脂平板上劃線(xiàn)分離培養。 

1.4.6.2動(dòng)物回歸試驗   30日齡斷奶仔豬6只，分成兩組， 一組腹腔注射2 mL分離菌( 含2×1 0⁷ C F U／m L)血清肉湯培養物。另一組腹腔注射2 mL無(wú)菌血清肉湯作對照。觀(guān)察仔豬發(fā)病及死亡情況，對死亡的立即解剖，觀(guān)察其病理變化。無(wú)菌采取肝臟、脾臟病料，涂片， 革蘭氏染色，鏡檢。并在鮮血瓊脂平板上劃線(xiàn)分離培養。 

1.5紙片擴散法藥敏試驗

將純菌株接種到馬丁瓊脂斜面， 37℃培養 18～24 h 后用滅菌生理鹽水洗下，并稀釋菌液使其含菌數為 1.5× 10 ⁶ 個(gè)／mL 。用滅菌棉拭子挑取菌液在瓊脂平板上向一個(gè)方向均勻涂布，然后將平板每轉動(dòng) 6 0。涂布 1次，共涂3次，最后沿平板邊緣涂布一圈。加蓋后放置5 mi n ， 待平板稍干后用鑷子將藥敏紙片平放在平板上，并輕壓使其緊貼平板表面。 每個(gè)平板貼 4張藥敏紙片， 兩紙片相距25 mm， 紙片與平板邊緣不小于15 mm， 貼好紙片的平板于3 7℃培養1 8 h后觀(guān)察結果。  

2 結果

2.1細菌鑒定

2.1.1 細菌分離結果從病死豬肺臟、心血、肝臟、腸系膜淋巴結均分離到一株具有α溶血的純細菌培養物。 

2.1.2形態(tài)結構及染色性 分離菌為革蘭氏陽(yáng)性，菌體呈圓形，多呈雙球形或短鏈狀，液體培養物中鏈較長(cháng)， 一般由8～ 15個(gè)球菌排成鏈狀，無(wú)鞭毛，無(wú)芽胞，不運動(dòng)，無(wú)莢膜，無(wú)粘液層，無(wú)兩極著(zhù)色現象。

2.1.3培養特性  分離菌為兼性厭氧菌，無(wú)運動(dòng)性：在普通營(yíng)養瓊脂平板上生長(cháng)極貧瘠，培養2 4 h后僅在劃線(xiàn)處見(jiàn)有針尖大小的菌落；血清肉湯中血清肉湯渾濁，不形成菌膜，培養48 h后上清較透明，底部有顆粒狀沉淀。在血瓊脂平板上生長(cháng)好， 37℃、2 4 h 即能長(cháng)出灰白色、圓形、透明、閃光、中央隆起、表面光滑露珠狀小菌落，菌落周?chē)�呈α溶血：在麥康凱瓊脂平板上不生長(cháng)。 

2.1.4生化試驗結果( 見(jiàn)表 1 ) 表中表明分離細菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說(shuō)明分離的菌均為豬鏈球菌。 

表 1 分離菌生化試驗結果

 

2.1.5血清學(xué)試驗 將細菌懸液與 I ／I I 及 I I 型抗血清混合， 立即可見(jiàn)明顯的凝集現象，但不與 I型 及其他型抗血清出現凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。 陰性對照均未見(jiàn)凝集現象。 

2.1.6致病性試驗

2.1.6.1 分離菌對小白鼠致病性  小白鼠于感染后5 h開(kāi)始死亡，至15 h全部死亡。死后解剖可見(jiàn)肝、脾、腎腫大，胸腔積液，用心血及胸積液涂片革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現有大量單個(gè)、 成對或4～2 0個(gè)左右的短鏈革蘭氏陽(yáng)性球菌。對照組小白鼠未見(jiàn)異常。 

2.1.6.2動(dòng)物回歸試驗  腹腔感染仔豬于接種后24 h開(kāi)始死亡，至48 h全部死亡。 剖檢，空腸、回腸嚴重充血、出血 ，心肌、肺臟出血，胸腔積液，積液涂片革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)大量單個(gè)成對或成長(cháng)鏈的革蘭氏陽(yáng)性球菌。對照組仔豬表現正常。通過(guò)以上鑒定，確定此菌為豬鏈球菌I I 型。 

2.2藥敏試驗

分離菌株對萬(wàn)古霉素、氨芐西林、頭孢拉定、利福平、羅紅霉素高度敏感，對青霉素鉀、 氨芐青霉素中度敏感，對鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、復方新諾明、 環(huán)丙沙星、克林霉素不敏感。 

2.3疾病控制

采取飼養環(huán)境和飼料消毒、發(fā)病豬隔離、氨芐西林和利福平配合治療等措施，有效地控制了疫情，未發(fā)生人的感染。  

3 討論

3.1鑒于 I I 型豬鏈球菌感染不僅造成大量豬的死亡， 也因可引起急性高死亡率的人STSS 和SMS 而頗受關(guān)注。為了能及時(shí)發(fā)現并控制豬群中I I 型豬鏈球菌感染，疑似病、死豬標本中的I I 型豬鏈球菌分離及鑒定是至關(guān)重要的病原學(xué)依據。實(shí)驗結果表明，在分離菌落的基礎上，采用豬鏈球菌 I I 型診斷血清的玻片凝集試驗能快速鑒定豬鏈球菌，且具有簡(jiǎn)便、 廉價(jià)、 準確等優(yōu)點(diǎn)。

3.2從理論上講，豬鏈球菌的抵抗力不強，治療上很多藥物都應有效，但從藥敏試驗及臨床治療來(lái)看，常用藥物的敏感性很低，多表現耐藥，所分離病原菌表現多重耐藥性，這與本實(shí)驗室 2 0 0 1 年在同一地區所做的同一試驗結果存在著(zhù)較大差異，這主要與濫用藥物及用藥習慣有關(guān)。 因此，對于鏈球菌病的治療早期可采用2～ 3 種藥物試驗性治療，最好在藥敏試驗基礎上合理用藥。使用藥物預防時(shí)應避免長(cháng)期使用同一種藥物， 可幾種藥物交替使用。

3.3 近幾年來(lái)，在我國部分省、市爆發(fā)流行豬鏈球菌 I I 型，對人的健康造成了嚴重危害。因此，飼養員、獸醫、管理人員以及屠宰場(chǎng)工人等接觸病豬、剖檢死亡豬和處理污染物時(shí)要特別注意自身的防護，防止被感染。