應用不同培養基檢測單增李斯特菌結果比較

    據中國預防醫學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所的報告顯示，單核細胞增生李斯特菌 ( Listeria monocytogenes，單增李斯特菌) 已經(jīng)成為2 1世紀可能對中國人衛生健康有重大影響的病原微生物之一。該菌廣泛分布于環(huán)境中，由該菌引起的污染是一個(gè)典型的環(huán)境衛生問(wèn)題。 

    世界衛生組織關(guān)于單增李斯特菌食品中毒的報告中指出，4％-8％的水產(chǎn)品、5%-10％的乳及乳制品、30％以上的家禽均被該菌污染。由于該菌在4 ~ C冰箱保存的食品中也能生長(cháng)繁殖，使其危害性更進(jìn)一步增大。據報道，約85％-90％的病例是由被污染的食品引起的。為此，各國均建立了單增李斯特菌標準檢測方法和快速檢測方法，顯色培養基作為快速方法中的一種，已經(jīng)越來(lái)越多地被運用。法國A ES  Laboratoire 和 CHROMagar 公司已有商品化的培養基，并得到了諸如FDA 、ISO等標準化組織的正式批準。本實(shí)驗觀(guān)察上述2種顯色培養基與傳統方法比較，樣品中單增李斯特菌的菌落特征以及快速檢測的敏感性和特異性。 

 

1 材料與方法

1.1材料

 

1.1.1菌株來(lái)源 標準菌株( 英諾克李斯特菌) 由本中心菌種保藏室提供； 試驗菌株來(lái)自食品檢測樣品，主要包括：奶制品、肉制品、海鮮類(lèi)產(chǎn)品和蔬菜，共計2 6 8份。 

 

1.1.2培養基 傳統培養基 MMA、 OXA由本中心培養基室制備。顯色培養基ALOA出自法國A E S  L a b o r a t o i r e 公司， C H R O M a g a r   L i s t e r i a出自法國 C H R O Ma g a r 公司。所有培養基均在有效期內配制并使用。 

 

1.2方 法

 

1.2.1標準菌株 取標準菌株酪胨大豆酵母浸膏肉湯( T S B—Y E) 培養物，分別劃線(xiàn)接種于 M MA 、O X A、A L O A和C H R O Ma g a r  L i s t e r i a 培養基平板上，3 5℃培養2 4-4 8 h ，觀(guān)察菌落生長(cháng)特征。 

 

1.2.2檢測樣品   每份樣品取2 5 g ( 或2 5 m L ) ， 加入225 m L 改良緩沖蛋白胨 ( M B P) ， 固狀樣品高速均質(zhì)1-2 m i n ，充分振搖制成1 ：1 0樣 品， 3 0℃培養 1 8—2 4 h 。  移取1 m L ， 轉種于 1 0 0 m L增菌培養液( E B ) 中， 3 0℃培養2 4 h和 4 8 h 。分別取增菌液一環(huán) ， 劃線(xiàn)接種于 MM A、 O X A、 A L O A 和 C H R O M a g a r   L i s t e r i a培養基平板上， 予 35℃培養2 4-48 h 。挑取可疑菌落， 劃線(xiàn)接種到胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂( T S A— Y E ) ， 置于3 5℃純培養 2 4 h ； 另轉種于 T S B—Y E置于3 5 ℃純培養 2 4 h ， 進(jìn)行鑒定實(shí)驗。最后， 以A P I —L i s t e r i a 板條和 B溶血試驗作最終確認。 

 

2 結果

 

2.1菌落特征

李斯特菌屬細菌( L i s t e r i a  s p p ． ) 與單增李斯特菌在M MA和OX A上很難區分， 而在 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a和A L O A上由于 L i s t e r i a   s p p ． 缺少明顯的暈圈，很容易與單增李斯特菌區分開(kāi)來(lái)。A L O A上單增李斯特菌的菌落特征較為明顯，C HRO Ma g a r   L i s t e r i a上細菌大小差異較大，較大菌落邊緣粗糙，不透明暈圈也沒(méi)有 A L O A上的明顯( 見(jiàn)表 1 ) 。 

 

表1   單增李斯特菌及李斯特菌標準菌株在不同培養基上的菌落特征

 

2.2 鑒定情況

由于顯色培養基上單增李斯特菌有明顯的不透明暈圈， 故在C HRO Ma g a r  L i s t e r i a和 A L O A上檢 出的 L i s t e r i a s p p ． 不包括單增李斯特菌，可疑菌落最終被確定為單增李斯特菌的概率為 97.8％和 100.0％， 而 MMA和 OXA 分別 只 有 27.9％ ( 3 9／1 4 0)和 28.5％ ( 4 5／1 5 8) 。 C H R O M a g a r   L i s t e r i a 培養基上有 1例單增李斯特菌的可疑菌落最終被排除 ， 經(jīng)確認為綿羊李斯特菌( 見(jiàn)表 2 ) 。 

 

表 2 單增李斯特菌可疑菌落在不同培養基中的鑒定情況

 

    在268 件食品樣品中檢出單增李斯特菌45件，檢出率為16.8 ％。A L O A和 O X A均檢出了這45件單增李斯特菌；HROMa g a r  L i s t e r i a檢出4 4件， MMA檢出 39件 ( 見(jiàn)表3 ) 。顯色培養基與傳統培養基的結果有良好的一致性(  χ²= 0.09 ， P> 0.05) 。除了單增李斯特菌以外的 L i s te r i a   s p p ． 中， 英諾克李斯特菌的污染率較高， 在MMAOX A、 CHROMag a r   L i s t e r i a和 AL OA上分別 占 100.0％( 1 0 1／1 0 1 )、 98.2％ (1 1 1 ／ 1 1 3 ) 、 86.7％ ( 1 3 ／ 1 5) 和 95.2 ％( 2 0／2 1 ) 。 

 

表 3     2 6 8件樣品在不同培養基檢出李斯特菌的結果 比較

*：因大部分樣品的試驗周期較長(cháng)( 一般超過(guò) 3個(gè)月) ， 故單增李斯特菌的污染率較高

 

3 討論

     傳統培養基檢出單增李斯特菌一般需要 5～7 d ，而使用顯色培養基一般只需要4 d ， 陰性樣品( 無(wú)菌落生長(cháng))2d就可以排除。傳統培養基只能確定可疑菌落為李斯特菌屬， 然后再通過(guò)一定的生化試驗檢出單增李斯特菌。這個(gè)過(guò)程使檢測周期延長(cháng)，且增加了實(shí)驗的花費。而顯色培養基可直接從視覺(jué)上判讀，克服了上述的缺點(diǎn)。 

     OX A是以水解七葉苷為主要反應，李斯特菌屬大多能水解七葉苷，故傳統培養基不能很好地區分單增李斯特菌和其他種。C H R O Ma g a r   L i s t e r i a的作用原理是其含有D L一丙氨酸 一1 3一萘胺和 D一丙氨酸 一對硝基苯胺2種底物， 除了單增李斯特菌以外的其他李斯特菌屬細菌均含有分解這2種底物的酶， 因此可快速鑒別單增李斯特菌和其他李斯特菌。A L O A則是利用單增李斯特菌所特有的磷脂酶作用于相應的底物，使之釋放出顯色基團，從而區分單增李斯特菌和其他種。

英諾克李斯特菌是一種對人體非致病的李斯特菌，在顯色培養基上可以較好地區分它和單增李斯特菌。C H R O M a g a r   L i s t e r i a上 單增李斯特菌伴有白色暈圈；A L O A上單增李斯特菌菌落周?chē)�也有一明顯的不透明暈圈，而英諾克李斯特菌則沒(méi)有相應的暈圈。C H R O Ma g a r L i s t e r i a上英諾克李斯特菌檢出1 3件( 86.7 ％) ， 在 AL O A上為20件( 95.2 ％) 。而在 MMA上檢出 1 0 1件， OXA上檢出1 1 1件 ， 分別占可疑樣品數的7 2.1％( 1 0 1／1 4 0) 和70.3％( 1 1 1 ／1 5 8 ) ， 構成了可疑樣品數的主要部分。顯色培養基上英諾克李斯特菌可以直接與單增李斯特菌相區分，故單增李斯特菌的檢出率大大提高。在M M A 和OX A上難 以與單增李斯特菌相區分，需進(jìn)行進(jìn)一步的生化試驗加以區別。加之所占比例較高，所以對單增李斯特菌檢出造成一定的困難。雖然 OX A最終也將4 5件單增李斯特菌檢出， 但比起顯色培養基增加了相當的工作量和檢測周期。英諾克李斯特菌在選擇性增菌肉湯中的生長(cháng)對單增李斯特菌會(huì )產(chǎn)生一定的影響，因其會(huì )產(chǎn)生一種類(lèi)似抗生素的物質(zhì)來(lái)抑制單增李斯特菌的生長(cháng)，故在肉湯中處于生長(cháng)的相對優(yōu)勢，從而對單增李斯特菌的檢出會(huì )起到一定的反作用。由于在顯色培養基上單增李斯特菌能很好被區分開(kāi)來(lái)，可以較大程度地避免常規方法中用溶血試驗來(lái)區分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。 由于溶血試驗的結果判讀受主觀(guān)因素影響較大，因此會(huì )對結果產(chǎn)生一定的影響。

    在C H R O M a g a r   L i s t e r i a 上綿羊李斯特菌表現出與單增李斯特菌相同的菌落形態(tài)，故無(wú)法從視覺(jué)上區分這 2 種細菌。但綿羊李斯特菌在環(huán)境中出現的概率非常低，對 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a 上可疑菌落檢出單增李斯特菌不會(huì )造成太大的影響。