不同環(huán)境溫度下的大腸桿菌數量監測及生存機制研究

    環(huán)境監測中，生物監測能準確地反映環(huán)境污染物對生物和人體是否有害以及其影響有多大，具有物理-化學(xué)監測無(wú)法替代的優(yōu)越性。由于生物監測在我國起步較晚，尚沒(méi)有形成法定的生物監測指標體系，目前的環(huán)境質(zhì)量定量考核、排污收費、許可證發(fā)放等環(huán)境管理重要環(huán)節除了細菌學(xué)個(gè)別指標外，大多數生物監測指標末能應用。然而隨著(zhù)經(jīng)濟的發(fā)展，城市人口的急劇增加，隨之而來(lái)的大量未經(jīng)處理的生活污水直接排放，其中攜帶的大量有害的病原菌、病毒，必定會(huì )對生態(tài)環(huán)境和人民身體健康產(chǎn)生較大的危害。例如1998年上海甲肝大流行，其原因就是食用受人糞便污染的毛蚶造成的。因而加強對目前生物監測中僅有的法定指標大腸桿菌的監測，對于環(huán)境保護和確保人民身體健康都具有重大的意義。然而目前我國絕大多數的環(huán)境監測部門(mén)都采用經(jīng)典的多管發(fā)酵法，在特定的環(huán)境條件下就有其一定的局限性。本文就不同環(huán)境溫度下大腸桿菌監測的各種方法進(jìn)行了比較和研究。

 

1.材料與方法

 

1.1實(shí)驗菌株

    實(shí)驗菌株為埃希氏大腸桿菌Escherichia coli ，由中國藥品生物制品檢定所菌種室提供。

 

1.2實(shí)驗水體

    容積為1L的三角瓶?jì)妊b800ml 經(jīng)0.2μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾并經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的自來(lái)水， 用帶有2ml移液管橡皮塞密封。實(shí)驗過(guò)程中的取樣用注射器通過(guò)移液管頭上的密封的乳膠頭取樣。

    菌種經(jīng)液體營(yíng)養培養劑在37℃下振蕩培養24h，分別加入實(shí)驗水體中，使細菌濃度為 10⁸個(gè) /ml。

    將該實(shí)驗裝置分別置于5℃和25℃和溫度環(huán)境中，定時(shí)取樣計數。

 

1.3計數方法

 

    平板計數法：采用常規涂布平板法，37℃24h后計數。培養基為營(yíng)養瓊指和伊紅美蘭瓊脂。

    多管發(fā)酵法：采用五管法，培養劑為液體EC培養基。

    細菌總數：采用AODC法， 具體操作按徐懷恕方法進(jìn)行。

    活菌直接計數：采用Kogure等方法：向水樣加入0.002%萘啶酮酸（Sigma 公司）和0.025%酵母膏，在37℃下培養6-24h，加入甲醛（最終濃度為2%）固定，再按AODC法鏡檢計數。

 

2. 結果與討論

    很長(cháng)時(shí)間以來(lái)，人們都用培養法來(lái)評價(jià)細菌的數量，20世紀70年代以后隨著(zhù)檢測細胞活性和放射性自顯影等新技術(shù)的應用，科學(xué)家們發(fā)現一些細菌在受到環(huán)境壓力時(shí)，細菌會(huì )失去在常規培養基上的生長(cháng)能力，但細菌仍是活的。當人們監測環(huán)境的污染程度時(shí)，這種活的非可培養狀態(tài)就有特別重要的意義。各國科學(xué)家對此進(jìn)行了大量的研究，很多種細菌如弧菌屬的大部分種:沙門(mén)氏氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞鏈球菌、惡臭假單胞菌、 索氏志賀氏菌、空腸彎曲桿菌等等都被證實(shí)能夠進(jìn)入活的非可培養狀態(tài)，并且隨著(zhù)研究的深入這類(lèi)細菌的種類(lèi)正在不斷地增加，可以肯定污水中也存在大量的這類(lèi)細菌，對于這些細菌的活的非可培養狀態(tài)的研究是正確全面評價(jià)污染物排放對生態(tài)環(huán)境影響的一個(gè)重要方面。我們以埃希氏大腸桿菌（E.coli）為研究對象，以5℃和25℃為環(huán)境溫度，進(jìn)行污水細菌生存機制的研究。

 

2.1  5℃環(huán)境中的細菌生存

E.coli 在5℃環(huán)境中的生長(cháng)情況見(jiàn)表1

 

表1 5℃下的大腸桿菌數量（單位：個(gè)/ml）

 

在整個(gè)試驗過(guò)程中， 細菌總數（ AODC 法） 和活菌數（DVC法）變化不大， DVC值比AODC 值低一個(gè)數量級左右，而通過(guò)多管發(fā)酵法和涂布平板法的數量，隨著(zhù)時(shí)間的推移逐步減少。從實(shí)驗初期的10⁴個(gè)/ml減少到10-100個(gè)/ml。直接鏡檢法測得的細菌總數不變， 而培養法測的細菌數明顯下降， 說(shuō)明細菌正逐步失去“ 可培養性” ，進(jìn)入一種非可培養狀態(tài)。但是可培養細菌數量的減少比較緩慢，直到實(shí)驗結束時(shí)（ 第56天） 還維持 10-100個(gè)/ml， 沒(méi)有完全進(jìn)入非可培養狀態(tài)。

 

2.2  25℃環(huán)境中的細菌數量

 

E.coli在25℃ 的生長(cháng)見(jiàn)表2，可以看出細菌總數（AODC法）和活菌數（DVC 法）在實(shí)驗期間數量變化不大，DVC值比AODC值低一個(gè)數量級左右，與5℃情況相同。相對而言， 多管發(fā)酵法和涂布平板法的數量隨著(zhù)時(shí)間的推移，以較快的速度減少，第29天可培養數為零， 說(shuō)明完全進(jìn)入了非可培養狀態(tài)。

 

表2   25℃下的大腸桿菌數量（單位：個(gè)/ml）

 

 

    關(guān)于E.coli的非可培養狀態(tài)，Colwell、Oliver、Linder、Byrd和中國的徐懷恕等人均有報道。 從本試驗的數據來(lái)看， 低溫5℃雖然能使可培養細菌數減少， 但速度很緩慢，在第56d 還維持著(zhù)10-100個(gè)/ml的濃度，而在25℃下，可培養細菌數反而迅速降低，第29d時(shí)已降為零。G.Bogosian 在研究E.coli在河水中的死亡率時(shí)，發(fā)現在沒(méi)有滅菌的土壤浸液中E.coli在4℃下100d時(shí)細菌數量為100個(gè)/ml(起始濃度為10⁹個(gè)/ml） ， 在 37℃時(shí)12天就達到了這個(gè)數量。與我們的實(shí)驗結果相似，可以認為在較高的溫度下容易進(jìn)入非可培養狀態(tài)，在較低的溫度下反而需要比較長(cháng)的時(shí)間。 同樣的情況Rollins和Colwell在1986年作了報道， 他們的實(shí)驗菌種為C.jejuni,在37℃時(shí)該菌在10d左右的時(shí)間內完全進(jìn)入了非可培養狀態(tài)，而在 4℃時(shí)在120d后卻還保持著(zhù)較高的可培養菌數。1992年Medema重復了這個(gè)試驗并作了報道。另外，Hussong在1987年對L.pheumophular 的非可培養研究中， 得到了類(lèi)似的結果。因此， 低溫雖然是許多細菌（ 如Vibrio vulnificus ） 進(jìn)入非可培養狀態(tài)的重要條件，但是不同的細菌并不都是如此。既使同種細菌間進(jìn)入非可培養狀態(tài)的時(shí)間也不盡相同。

 

3.小結

    以埃希氏大腸桿菌E.coli 為試驗對象，研究了細菌在不同溫度下的生存機制，結果發(fā)現：該細菌進(jìn)入水體后，無(wú)論在低溫5℃下還是在高溫25℃下都會(huì )進(jìn)入非可培養狀態(tài)，即用常規培養法難以檢測， 但細菌仍是活的。因而污水排放后，大量的細菌可能以活的非可培養狀態(tài)存在，用常規的監測方法難以正確表達其數量。有的還會(huì )寄生在浮游生物體內，在適宜的環(huán)境條件下又會(huì )復活。這就要求我們在日常工作中除了常規監測，應盡可能地應用新的技術(shù)如：熒光顯微鏡直接鏡檢法、熒光單克隆抗體培養等監測手段，努力作到客觀(guān)、準確、 全面地反映污染排放對生態(tài)環(huán)境的影響以及對人民生命健康的潛在威脅。