菌種的衰退、復壯和保藏

 在微生物的基礎研究和應用研究中，選育一株理想菌株是一件艱苦的工作，而要保持菌種的遺傳穩定性更是困難。菌種退化是一種潛在的威脅，因此引起人們的研究與重視。

一、菌種退化現象

    菌種退化（ degeneration ）是指群體中退化細胞在數量上占一定數值后，表現出菌種生產(chǎn)性能下降的現象。常表現為，在形態(tài)上的分生孢子減少或顏色改變，甚至變形，如放線(xiàn)菌和霉菌在斜面上經(jīng)多次傳代后產(chǎn)生了“光禿”型，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；在生理上常指產(chǎn)量的下降，例如，黑曲霉的糖化能力、抗生素生產(chǎn)菌的抗生素發(fā)酵單位下降等。造成菌種退化的原因主要有：

( 一 ) 自然突變

    微生物與其他生物類(lèi)群相比最大的特點(diǎn)之一就是有較高的代謝繁殖能力，在 DNA 大量快速復制過(guò)程中，因出現某些基因的差錯從而導致突變發(fā)生，故繁殖代數越多，突變體的出現也越多。一般來(lái)說(shuō)，微生物的突變常常是負突變，是指使菌種原有的優(yōu)良特性喪失或導致產(chǎn)量下降的突變。只有經(jīng)過(guò)大量的篩選，才有可能找到正突變。

( 二 ) 環(huán)境條件

    環(huán)境條件對菌種退化的影響，如營(yíng)養條件，有人把泡盛曲霉的生產(chǎn)種，在 3 種培養基上連續傳代 10 次，發(fā)現不同培養基和傳代次數對淀粉葡萄糖苷酶的產(chǎn)量下降有不同影響，說(shuō)明營(yíng)養成分影響菌種退化的速度。環(huán)境溫度也是重要的作用因素。例如，溫度高，基因突變率也高，溫度低則突變率也低，因比菌種保藏的重要措施就是低溫。其他環(huán)境因子，如紫外線(xiàn)等誘變劑也可加速菌種退化。

（三）衰退的防止

①控制傳代次數；②創(chuàng )造良好的培養條件；③利用不同類(lèi)型的細胞進(jìn)行接種；④采用有效的菌種保藏方法。

（四）退化菌種的復壯

    因為在退化的菌種中仍有一些保持原有菌種特性的細胞，故有可能采取一些相應措施，使這些細胞生長(cháng)、繁殖，以更新退化的菌株，稱(chēng)之為菌種的復壯。常用方法是①純種分離；②通過(guò)宿主體內生長(cháng)進(jìn)行；③淘汰已衰退的個(gè)體。

二、菌種的保藏

    經(jīng)誘變篩選、分離純化以及純培養等一系列艱苦勞動(dòng)得到的優(yōu)良菌株，能使其穩定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染，這就是菌種保藏的任務(wù)。

( 一 ) 原理

    人為地創(chuàng )造合適的環(huán)境條件，使微生物的代謝處于不活潑、生長(cháng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工環(huán)境主要從低溫、干燥、缺氧 3 方面設計。

（二）常用方法

    菌種的保藏方法多樣，采取哪種方式，要根據保藏的時(shí)間、微生物種類(lèi)、具備的條件等而定。下面著(zhù)重介紹幾種常用的保藏方法。

1 ．斜面保藏法

    將菌種接種在試管斜面培養基上，待菌種生長(cháng)完全后，置于 4 ℃ 冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間再轉接至新的斜面培養基上，生長(cháng)后繼續保藏。對細菌、放線(xiàn)菌、霉菌和酵母菌均可采用。此方法簡(jiǎn)單、存活率高，故應用較普遍。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定的代謝強度，傳代多則菌種易變異，故不宜長(cháng)時(shí)間保藏菌種。

2 ．液體石蠟覆蓋保藏法

    為了防止傳代培養菌因干燥而死亡，也為限制氧的供應以削弱代謝水平，在斜面或穿刺的培養基中覆蓋滅菌的液體石蠟。主要適用于霉菌、酵母菌、放線(xiàn)菌、好氧性細菌等的保存。霉菌和酵母菌可保存幾年，甚至長(cháng)達 10 年。本法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單不需特殊裝置。其缺點(diǎn)是對很多厭氧細菌或能分解烴類(lèi)的細菌的保藏效果較差。液體石蠟要求選擇優(yōu)質(zhì)無(wú)毒，一般為化學(xué)純規格�？梢栽� 121 ℃ 濕熱滅菌 20min 。要求液體石蠟的油層高于斜面頂端 1cm ，垂直放在 4 ℃ 冰箱內保藏。

3 ．載體保藏法

    使微生物吸附在適當的載體上 ( 土壤、砂子等 ) 進(jìn)行干燥保存的方法。最常用的有砂土保藏法。主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物 ( 真菌、放線(xiàn)菌和部分細菌 ) 的保存。此法簡(jiǎn)便，保藏時(shí)間較長(cháng)，微生物轉接也較方便，故應用范圍較廣。

4 ．冷凍干燥保藏法

    這是最佳的微生物菌體保存法之一，保存時(shí)間長(cháng)，可達 10 年以上。低溫冷凍可以用普通 -20 ℃ 或更低的 -50 ℃ 、 -70 ℃ 冰箱，用液氮 (-196 ℃ ) 更好。無(wú)論是哪種冷凍，在原則上應盡可能速凍，使其產(chǎn)生的冰晶小而減少細胞的損傷。不同微生物的最適冷凍速度不同。為防止細胞被凍死，

    保存液中應加些保護劑，例如甘油、二甲亞礬等，它們可透入細胞，通過(guò)降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質(zhì)如脫脂牛奶、血清白蛋白等，可通過(guò)與細胞表面結合的方式防止細胞膜受凍傷。其缺點(diǎn)是手續麻煩、需要條件高。

    另外還有懸液保藏法、寄主保藏法、液氮保藏法等。