基因重組——原核微生物的基因重組

 凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內的遺傳基因轉移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新重組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱(chēng)為基因重組。重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。

    基因重組是雜交育種的理論基礎。由于雜交育種選用已知性狀的供體菌和受體菌作為親本。因此比誘變育種前進(jìn)了一大步。同時(shí)也可消除某一菌株長(cháng)期誘變導致產(chǎn)量上升緩慢現象。因此它是一種重要的育種手段。

 

原核微生物的基因重組

（一）轉化 (transformation)

    轉化是細菌中最早被發(fā)現的遺傳物質(zhì)轉移形式。 l928 年 Griffith 用肺炎鏈球菌對小鼠的感染實(shí)驗以及 10 多年后 Avery 等體外轉化過(guò)程的實(shí)現，轉化因子 DNA 的證實(shí)，是現代生命科學(xué)發(fā)展的重要起點(diǎn)。

1 ．幾個(gè)概念

    轉化 受體菌直接吸收了來(lái)自供體菌的 DNA 片段，通過(guò)交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了新的遺傳特性的現象。

    轉化子（ transformant ） 受體細胞經(jīng)復制分裂后出現了供體性狀的子代。

    感受態(tài) (competence) 細菌能夠從周?chē)�環(huán)境中吸收 DNA 分子進(jìn)行轉化的生理狀態(tài)。

2 ．轉化的條件

    包括受體菌與外源 DNA 的條件。

    受體菌 只有處于感受態(tài)的細菌才能吸收外源 DNA 實(shí)現轉化。細菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài)，它可以通過(guò)感受態(tài)因子（細菌生長(cháng)到一定階段分泌一種小分子的蛋白質(zhì)）在細胞間的轉移而獲得。這種感受態(tài)因子與細胞表面受體相互作用，誘導一些感受態(tài) -- 特異蛋白表達，其中一種是自溶素，它的表達使細胞表面的 DNA 結合蛋白及核酸酶裸露出來(lái)，使其具有與 DNA 結合的活性。

    現在可用人工的方法提高受體菌感受態(tài)的水平，通過(guò)以 CaCl₂ 、 cAMP 等處理，后者可使感受態(tài)水平提高 10000 倍。

    外源 DNA 必須具備兩個(gè)基本條件，即具有高相對分子質(zhì)量和同源性：①轉化 DNA 的相對分子質(zhì)量通常在 1 × 10 ⁷ 以下，約占細菌染色體組的 0.3 ％，否則活性喪失；多數研究中，基因轉移使用的是雙鏈線(xiàn)性 DNA ，某些單鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA 也可用于轉化；②親緣關(guān)系越近， DNA 的純度越高，則轉化率越高。

3 ．轉化過(guò)程

    主要通過(guò) 3 個(gè)步驟完成。

    感受態(tài)細胞的建立 可用人工方法提高受體菌的感受態(tài)水平，通常以 CaCl ₂ 、 cAMP 等處理菌體，后者可使感受態(tài)水平提日 l0 000 倍。

    DNA 的結合和攝取 首先是供體雙鏈 DNA 與受體細胞壁上的接受位點(diǎn)相結合。此反應的最初是可逆的，但隨著(zhù)與細胞膜蛋白的進(jìn)一步作用，其與細胞壁的結合則變得十分穩定而不可逆。隨后其中一條鏈被細胞表面上的核酸酶降解，降解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條鏈推進(jìn)受體細胞。亦發(fā)現有完整的雙鏈被攝取的情況，如革蘭氏陰性菌——嗜血桿菌。

    轉化因子與染色體重組 當單鏈進(jìn)入受體細胞后，便與雙鏈結構的受體染色體 DNA 同源片段發(fā)生交換重組。即與受體菌 DNA 整合，形成供體 DNA-- 受體 DNA 復合物，再通過(guò) DNA 復制和細胞分裂而表現出轉化性狀，形成轉化子。

    能夠發(fā)生轉化的微生物有：肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬和根瘤菌屬等 20 多種菌。轉化性狀也多樣：如形態(tài)變化、莢膜物質(zhì)、糖發(fā)酵、耐藥性、抗原性、致病力、代謝產(chǎn)物、營(yíng)養需要等的變化。一般轉化率為 0.1 ％一 1 ％。

    如果把噬菌體或其他病毒的 DNA （或 RNA ）抽提出，用它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代，這種特殊的轉化稱(chēng)為轉染。

( 三 ) 轉導 (transduction)

    1952 年 Zinder 和 Lederberg 在驗證鼠傷寒沙門(mén)氏菌是否也存在接合現象時(shí)發(fā)現了轉導現象。

    通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的 DNA 片段攜帶到受體細胞中，通過(guò)交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現象，稱(chēng)為轉導。獲得新性狀的受體細胞，稱(chēng)為轉導子 (transductant) 。攜帶供體部分遺傳物質(zhì) (DNA 片段 ) 的噬菌體稱(chēng)為轉導噬菌體。在噬菌體內僅含有供體菌 DNA 的稱(chēng)為完全缺陷噬茵體；在噬菌體內同時(shí)含有供體 DNA 和噬菌體 DNA 的稱(chēng)為部分缺陷噬菌體 ( 部分噬菌體 DNA 被供體 DNA 所替換 ) 。根據噬菌體和轉導 DNA 產(chǎn)生途徑的不同，可將轉導分為普遍性轉導和局限性轉導。

1 ．普遍性轉導 (general transduction)

    通過(guò)完全缺陷噬菌體對供體菌任何 DNA 小片斷的“誤包”，而實(shí)現其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉導現象，稱(chēng)為普遍性轉導。

    普遍性轉導的機制——“包裹選擇模型”，當噬菌體侵染敏感細菌并在細菌內大量復制增殖時(shí)，亦把寄主 DNA 降解為許多小的片段，在裝配時(shí)，少數噬菌體 (10 -6 一 10 -8 ) 錯誤地包裝了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌體”，這種噬菌體稱(chēng)普遍性轉導噬菌體 ( 為完全缺陷噬菌體 ) 。隨著(zhù)細菌的裂解，轉導噬菌體也被大量釋放。當這些轉導噬菌體再次侵染受體菌時(shí)，其中的供體 DNA 片段被注入受體菌。

    如果該 DNA 片段能與受體菌 DNA 同源區段配對，通過(guò)遺傳物質(zhì)的雙交換而進(jìn)行基因重組并形成穩定的轉導子，稱(chēng)完全普遍性轉導。如鼠傷寒沙門(mén)氏菌的 P22 噬菌體、大腸桿菌的 P1 噬菌體和枯草芽孢桿菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌體中都能進(jìn)行完全轉導。

    如果該 DNA 片斷不能與受體菌 DNA 進(jìn)行交換、整合和復制，只以游離和穩定的狀態(tài)存在，而僅進(jìn)行轉錄、轉譯和性狀表達，稱(chēng)流產(chǎn)轉異。發(fā)生流產(chǎn)轉導的細胞在其進(jìn)行分裂后，只能將這段外源 DNA 分配給一個(gè)子細胞，而另一子細胞僅獲得供體基因轉錄、轉譯而形成的少量產(chǎn)物 -- 酶，因此在表型上仍可出現輕微的供體菌特征，每經(jīng)分裂一次，就受到一次“稀釋”。所以能在選擇培養基上形成微小菌落就成了流成轉導子的特點(diǎn)。

2 ．局限性轉導 (specialized transduction)

    通過(guò)部分缺陷噬的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉導現象）。轉導后獲得了供體部分遺傳特性的重組受體細胞稱(chēng)為局限轉導子。

(1) 局限性轉導的機制——“雜種形成模型” λ噬菌體的線(xiàn)狀雙鏈 DNA 分子的兩端為 12 個(gè)核苷酸單鏈（粘性未端 cos 位點(diǎn)），在溶源狀態(tài)下，以前噬菌體狀態(tài)存在于細胞染色體上。被誘導后，在裂解細菌時(shí)，其以粘性末端形成的環(huán)狀分子通過(guò)滾環(huán)復制形成一個(gè)含多個(gè)基因組的 DNA 多聯(lián)體，以 2 個(gè) cos 位點(diǎn)之間的距離決定其包裝片段的大小而進(jìn)行切割、包裝，最終形成轉導噬菌體。在極少數情況下 ( 約 10 -5 ) ，在前噬菌體兩端鄰近位點(diǎn)上與細菌染色體發(fā)生錯誤的切割，使其重新形成的環(huán)狀 DNA 中，同時(shí)失去前噬菌體的一部分 DNA 和增加了一段相應長(cháng)度的細菌宿主染色體 DNA ，這樣形成的雜合 DNA 可正常被包裝、復制。形成的新轉導噬菌體稱(chēng)為部分缺陷噬體。因為λ前噬菌體位點(diǎn)兩端是細菌染色體的 gal + ( 發(fā)酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ，故形成的轉導噬菌體通常帶有 gal + 或 bi0 + 基因，故這些部分缺陷噬菌體表示為λ dga1( 缺陷型半乳糖轉導噬菌體 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素轉導噬菌體 ) 。這些轉導噬菌體可重新侵入受體菌，侵入后，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區段配對，通過(guò)雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性。

（ 2 ）局限性轉導中的低頻轉導與高頻轉導 低頻轉導 (LFT) ：由于宿主染色體上進(jìn)行不正常切離的頻率極低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例是極低（ 10 -4 --10 -6 ）的，這種裂解物稱(chēng)為 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情況下感染宿主，就可獲得極少量的轉導子。高頻轉導 (HFT) ：形成轉導子的頻率很高，理論上可達 50 ％，故稱(chēng)之為高頻轉導。其原因是因為供體菌為雙重溶源菌，它同時(shí)有兩種噬菌體整合在細菌的染色體上。例如，大腸桿菌 K12 株，其雙重溶源菌為 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬體體有λ和λ dg 為缺陷噬菌體，帶有供體 gal + 基因，但丟失了部分噬菌體本身的 DNA ；而λ噬菌體為正常噬菌體，不帶 gal 基因，但起輔助作用，稱(chēng)為輔助噬菌體，可彌補λ dg 的不足，使λ dg 也能成為“完整噬菌體”而釋放。這樣，一個(gè)細菌便可同時(shí)等量地釋放出λ dg 和λ兩種噬菌體，這時(shí)的裂解物稱(chēng)為 HFT 裂解物，當用低   m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一個(gè) E.coligal - 受體菌，是可高頻率的把它轉化為能發(fā)酵乳糖的 E.coligal + 轉導子。這種方式稱(chēng)為高頻轉導。

    當溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組，而使后者獲得了除免疫以外的新性的現象，稱(chēng)為溶源轉變。

( 三 ) 接合 (conjugation)

    指供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸，而實(shí)現大段的 DNA 傳遞現象。

    Iederberg 和 Tatum 于 1946 年設計了一個(gè)有名的實(shí)驗，才證明了原核生物的接合現象。他們篩選出了兩種不同營(yíng)養缺陷型的大腸桿菌 K12 突變株，其中 A 菌株是 met- 、 bio- ， B 菌株是 thr- 、 Leu- ，將它們在完全培養基上混合培養后，再涂布于基本培養基上。結果發(fā)現，在基本培養基上出現了 met + 、 bi0 + 、 thr + 、 1eu + 的原養型菌落 ( 約為 10 -7 ) ，而分別涂布的兩種親本菌株對照組都不出現任何菌落。進(jìn)一步的實(shí)驗證實(shí)，上述遺傳重組的形成，是兩個(gè)親本細胞接合以后發(fā)生基因重組的結果。在細菌中，接合現象發(fā)研究最清楚的是 E.coli ，研究發(fā)現 E.coli 是有性別分化的，決定性別的是一種質(zhì)粒，即 F 因子�，F在根據 E.coli 細胞中是否存在 F 因子以及在細胞中的存在方式不同，可把大腸桿菌分成以下四種類(lèi)型。

    F + 菌株 F 因子以游離狀態(tài)存在，可獨立于染色體進(jìn)行自主復制。一般有 1-4 個(gè)，且細胞表面有相當數量的性菌毛。

    F - 菌株 不含 F 因子，無(wú)相當數量的性菌毛。

    Hfr 菌株 F 因子整合在宿主染色體的一定部位，并與宿主染色體同步復制。發(fā)現 Hfr 與 F - 菌重組的頻率要比 F + 菌與 F - 菌重組的頻率高得多。

    F ′菌株 因為 F 因子整合到染色體上是一種可逆過(guò)程，當 F 因子從 Hfr 菌染色體上脫落時(shí)，會(huì )出現一定概率的錯誤基因交換，從而使 F 因子帶上宿主染色體的遺傳因子，這時(shí)的 F 因子稱(chēng)為 F ′因子。

    幾種接合的結果

    F+ × F- 接合 通過(guò) F + 菌產(chǎn)生的性菌毛把兩者連接在一起，并在細胞間形成胞質(zhì)橋 ( 或稱(chēng)接管 ) ， F 因子通過(guò)胞質(zhì)橋進(jìn)入受體細胞，使重組體從 F - 變成了 F + 菌。其主要過(guò)程是， F 因子的一條 DNA 單鏈斷裂 ( 在特定位點(diǎn)上 ) 、解鏈，并單向轉移進(jìn)入受體細胞，在此作為模板而形成新的 F 因子；另一條在供體細胞內的 DNA 鏈也成為模板并以滾環(huán)模型形式復制；最終供體菌及受體菌均成為 F + 菌。

    Hfr × F- 接合 當 Hfr 與 F- 菌株發(fā)生接合時(shí)， Hfr 的染色體雙鏈中的一條單鏈在 F 因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫�(xiàn)狀， F 因子則位于線(xiàn)狀單鏈 DNA 之末端。整段線(xiàn)狀染色體也以 5- 末端引導，等速轉移至 F - 細胞。在沒(méi)有外界因素干擾的情況下，這一轉移過(guò)程的全部完成約需 100 分鐘。實(shí)際上由在轉移過(guò)程中，使接合中斷的因子很多，因此這么長(cháng)的線(xiàn)狀單鏈 DNA 常常在轉移過(guò)程中發(fā)生斷裂。所以處在 Ffr 染色體前端的基因，進(jìn)入 F- 的幾率就越高，這類(lèi)性狀出現在接合子中的就越早。由于 F 因子位于線(xiàn)狀 DNA 的末端，進(jìn)入 F- 細胞的機會(huì )最少，故引起 F- 變成 F+ 的可能性也最小。因此 Hfr 與 F- 接合的結果其重組頻率雖最高，但轉性頻率卻最低。

    F ′與 F- 接合 通過(guò) F ′與 F- 的接合就可以使后者變成 F ′。它既可使后者前者的 F 因子，同時(shí)雙獲得前者的部分遺傳性狀。

（四）原生質(zhì)體融合（ protoplast fusion ）

    通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的、遺傳性穩定的融合子（ fusant ）的過(guò)程 .

    能進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細胞是極其廣泛的，不僅包括原核生物，而且還包括各種真核細胞。原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性在于：

1 ．它打破了微生物的種屬界限，可以實(shí)現遠緣菌株的基因重組。 1981 年 Yamada 有 PEG 誘導酵母原生質(zhì)體與細菌細胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用實(shí)現了不穩定的表達。

2 ．原生質(zhì)融合可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組體的機會(huì )，有利于提高育種速度。

    此外原生質(zhì)體融合技術(shù)還可用于研究細胞質(zhì)遺傳、核質(zhì)關(guān)系等問(wèn)題，因此原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐及理論研究上均有具有重要意義。

    原生質(zhì)體融合技術(shù)及育種步驟

1 ．原生質(zhì)體的制備

    制備原生質(zhì)體是保證實(shí)現原生質(zhì)融合技術(shù)的關(guān)鍵。主要是要去除細胞壁。

2 ．原生質(zhì)體再生

    是指去壁后的原生質(zhì)體能重建細胞壁，恢復細胞完整形態(tài)，并能生長(cháng)、分裂的過(guò)程。這是原生質(zhì)融合育種的必要條件。通常在原生質(zhì)體融合前要測定原生質(zhì)體的再生率，以此分析其融合率不高是由于雙親株原生質(zhì)體本來(lái)就沒(méi)有活性或再生率低，還是由于融合條件不適所致。因此測定原生質(zhì)體形成率和再生率不僅可作為檢查、改善原生質(zhì)體形成和再生條件的指標，也是分析融合實(shí)驗結果，改善融合條件的一個(gè)重要指標。

3 ．原生質(zhì)體融合

    原生質(zhì)體融合方法 主要有生物助融（通過(guò)病毒聚合劑如仙臺病毒等病毒和某些生物提取物等使原生質(zhì)體融合）、物理助融（離心沉淀、電脈沖等）、化學(xué)助融（通過(guò)化學(xué)助融劑如 PEG 加 Ca 2+ ）。

4 ．融合子的檢出與鑒定

    原生質(zhì)體融合育種的主要目的在于迅速準確地檢出各種類(lèi)型的融合子，并通過(guò)鑒定、篩選等步驟，及時(shí)選出穩定高產(chǎn)的融合子。

①融合子的檢出

    直接檢出法 將融合液涂布于無(wú)雙親株生長(cháng)所必要的營(yíng)養物或存在抑制雙親生長(cháng)的抑制物的再生平皿上。

    間接法 用影印法

②融合子的鑒定

    經(jīng)過(guò)傳代選出穩定融合子，可從形態(tài)學(xué)、生理生化、遺傳學(xué)及生物學(xué)等幾方面進(jìn)行鑒定。如菌落形態(tài)和顏色變化，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量， DNA 含量分析等。