微生物的生長(cháng)規律

一、細菌群體生長(cháng)規律

    細菌接種到均勻的液體培養基后，當細菌以二分裂法繁殖，分裂后的子細胞都具有生活能力。在不補充營(yíng)養物質(zhì)或移去培養物，保持整個(gè)培養液體積不變條件下，以時(shí)間為橫坐標，以菌數為縱坐標，根據不同培養時(shí)間時(shí)細菌數量的變化，可以作出一條反映細菌在整個(gè)培養期間菌數變化規律的曲線(xiàn)，這種曲線(xiàn)稱(chēng)為生長(cháng)曲線(xiàn)稱(chēng)為生長(cháng)曲線(xiàn) (growth curve) 。一條典型的生長(cháng)曲線(xiàn)至少可以分為遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期等四個(gè)生長(cháng)時(shí)期。

1 ．遲緩期 (1ag phase) ．

    又稱(chēng)延滯期、適應期。細菌接種到新鮮培養基而處于一個(gè)新的生長(cháng)環(huán)境，因此在一段時(shí)間里并不馬上分裂，細菌的數量維持恒定，或增加很少。此時(shí)胞內的 RNA 、蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量有所增加，相對地此時(shí)的細胞體最大，說(shuō)明細菌并不是處于完全靜止的狀態(tài)。產(chǎn)生遲緩期的原因，認為是微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏足夠的能量和必需的生長(cháng)因子，“種子”老化 ( 即處于非對數生長(cháng)期 ) 或未充分活化，接種時(shí)造成的損傷等。在工業(yè)發(fā)酵和科研中遲緩期會(huì )增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響，但是遲緩期無(wú)疑也是必需的，因為細胞分裂之前，細胞各成分的復制與裝配等也需要時(shí)間，因此應該采取一定的措施： ① 通過(guò)遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短； ② 利用對數生長(cháng)期的細胞作為“種子”； ③ 盡量使接種前后所使用的培養基組成不要相差太大； ④ 適當擴大接種量等方式縮短遲緩期，克服不良的影響。

2 ．對數生長(cháng)期 (log phase)

    又稱(chēng)指數生長(cháng)期 (exponential Phase) 。細菌經(jīng)過(guò)遲緩期進(jìn)入對數生長(cháng)期，并以最大的速率生長(cháng)和分裂，導致細菌數量呈對數增加，而且細菌內各成分按比例有規律地增加，此時(shí)期內的細菌生長(cháng)是平衡生長(cháng)。對數生長(cháng)期細菌的代謝活性、酶活性高而穩定，大小比較一致，生活力強，因而它廣泛地在生產(chǎn)上用作“種子”和在科研上作為理想的實(shí)驗材料。

3 ．穩定生長(cháng)期 (stationary phase)

    由于營(yíng)養物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和 pH 等環(huán)境變化，逐步不適宜于細菌生長(cháng)，導致生長(cháng)速率降低直至零 ( 即細菌分裂增加的數量等于細菌死亡數量 ) ，結束對數生長(cháng)期，進(jìn)入穩定生長(cháng)期。穩定生長(cháng)期的話(huà)細菌數最高并維持穩定。如果及時(shí)采取措施，補充營(yíng)養物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養條件，如對好氧菌進(jìn)行通氣、攪拌或振蕩等可以延長(cháng)穩定生長(cháng)期，獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。

4 ．衰亡期 (decline 或 death Phase)

    營(yíng)養物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率逐步增加和活細菌逐步減少，標志進(jìn)入衰亡期。該時(shí)期細菌代謝活性降低，細菌衰老并出現自溶。該時(shí)期死亡的細菌以對數方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細菌產(chǎn)生抗性也會(huì )使細菌死亡的速率降低。

    此外，不同的微生物，甚至同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用 ( 例如葡萄糖或 NH 4 + 等 ) ；有的需要經(jīng)過(guò)一定的適應期后才能獲得利用能力 ( 例如乳糖或 NO 3 - 等 ) 。前者通常稱(chēng)為速效碳源 ( 或氮源 ) ，后者稱(chēng)為遲效碳源 ( 或氮源 ) 。當培養基中同時(shí)含有這兩類(lèi)碳源 ( 或氮源 ) 時(shí)，微生物在生長(cháng)過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生二次生長(cháng)現象。

二、同步培養

    微生物個(gè)體生長(cháng)是微生物群體生長(cháng)的基礎。但群體中每個(gè)個(gè)體可能分別是處于個(gè)體生長(cháng)的不同階段，因而它們的生長(cháng)、生理與代謝活性等特性不一致，出現生長(cháng)與分裂不同步的現象。同步培養 (synchronous culture) 是一種培養方法，它能使群體中不同步的細胞轉變成能同時(shí)進(jìn)行生長(cháng)或分裂的群體細胞。以同步培養方法使群體細胞能處于同一生長(cháng)階段，并同時(shí)進(jìn)行分裂的生長(cháng)方式稱(chēng)為同步生長(cháng)。通過(guò)同步培養方法獲得的細胞被稱(chēng)為同步細胞或同步培養物。同步培養物常被用來(lái)研究在單個(gè)細胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它是一種理想的材料。

    用一般培養方法獲得的細胞通常是不完全同步的細胞，就是同步培養方法獲得的同步細胞經(jīng)幾次傳代之后，也會(huì )出現不同步的現象。如何使不同步轉變?yōu)橥�步，以及如何使用同步細胞能較長(cháng)時(shí)間地保持同步，這是同步培養中要研究的課題。

    同步培養方法很多，可歸納為機械法與環(huán)境條件控制兩類(lèi)。

1 ．機械方法

    這是一類(lèi)根據微生物細胞在不同生長(cháng)階段的細胞體積與質(zhì)量或根據它們同某種材料結合能力不同的原理設計出來(lái)的方法。其中常用的有：

(1) 離心方法

    將不同步的細胞培養物懸浮在不被這種細菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通過(guò)密度梯度離心將不同細胞分布成不同的細胞帶，每一細胞帶的細胞大致是處于同一生長(cháng)期的細胞，分別將它們取出進(jìn)行培養，就可以獲得同步細胞。

(2) 過(guò)濾分離法

    將不同步的細胞培養物通過(guò)孔徑大小不同微孔濾器，從而將大小不同的細胞分開(kāi)，分別將濾液中的細胞取出進(jìn)行培養，獲得同步細胞。

(3) 硝酸纖維素濾膜法

    根據細菌能緊緊結合到硝酸纖維素濾膜上的特點(diǎn)，將細菌懸液通過(guò)墊有硝酸纖維素濾膜的過(guò)濾器，然后將濾膜顛倒過(guò)來(lái)，再將培養基流過(guò)濾器，以洗去末結合的細菌，然后將濾器放入適宜條件

    下培養一段時(shí)間，其后仍將培養基流過(guò)濾器，這時(shí)新分裂產(chǎn)生的細菌被洗下，分部收集并通過(guò)培養獲得同步細胞。

2 ．環(huán)境條件控制技術(shù)

    這類(lèi)技術(shù)是根據細菌生長(cháng)與分裂對環(huán)境因子要求不同的原理設計的一類(lèi)獲得同步細胞的方法。

(1) 溫度

    最適生長(cháng)溫度有利于細菌生長(cháng)與分裂，不適宜溫度如低溫不利于細菌生長(cháng)與分裂。通過(guò)適宜與不適宜溫度的交替處理之后，通過(guò)培養可獲得同步細胞。

(2) 培養基成分控制

    培養基中的碳、氮源或生長(cháng)因子不足，可導致細菌緩慢生長(cháng)直至生長(cháng)停止。因此將不同步的細菌在營(yíng)養不足的條件下培養一段時(shí)間，然后轉移到營(yíng)養豐富的培養基里培養，能獲得同步細胞。另外也可以將不同步的細胞轉接到含有一定濃度的，能抑制蛋白質(zhì)等生物大分子合成的化學(xué)物質(zhì)如抗生素等的培養基里，培養一段時(shí)間后，再轉接到完全培養基里培養也能獲得同步細胞。

(3) 其他

    對于光合細菌可以將不同步的細菌經(jīng)光照培養后再轉到黑暗中培養，這樣通過(guò)光照和黑暗交替培養的方式可獲得同步細胞；對于不同步的芽孢桿菌培養至絕大部分芽孢形成，然后經(jīng)加熱處理，殺死營(yíng)養細胞，最后轉接到新的培養基里，經(jīng)培養可獲得同步細胞。

    環(huán)境條件控制獲得同步細胞的機理不完全了解。這種處理可能是導致胞內某些物質(zhì)合成，它合成和積累可導致細胞分裂，從而獲得同步細胞。

三、連續培養

    連續培養 (continous culture of microorganisms) 是在微生物的整個(gè)培養期間，通過(guò)一定的方式使微生物能以恒定的比生長(cháng)速率生長(cháng)并能持續生長(cháng)下去的一種培養方法。根據生長(cháng)曲線(xiàn)，營(yíng)養物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導致微生物生長(cháng)停止的主要原因。因此在微生物培養過(guò)程中不斷的補充營(yíng)養物質(zhì)和以同樣的速率移出培養物是實(shí)現微生物連續培養的基本原則。

    在連續培養里，培養容器中細菌的數量一方面以比生長(cháng)速率的數量增加，同時(shí)又在以稀釋率的數量減少。

    連續培養有兩種類(lèi)型，恒化器連續培養和恒濁器連續培養。前者是在整個(gè)培養過(guò)程中通過(guò)控制培養基中某種營(yíng)養物質(zhì)的濃度基本恒定的方式，保持細菌的比生長(cháng)速率恒定，使生長(cháng)“不斷”進(jìn)行。培養基中的某種營(yíng)養物質(zhì)通常是作為細菌比生長(cháng)速率的控制因子，這類(lèi)因子一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無(wú)機鹽，生長(cháng)因子等物質(zhì)。恒化器連續培養通常用于微生物學(xué)的研究，篩選不同的變種。后者主要是通過(guò)連續培養裝置中的光電系統控制培養液中菌體濃度恒定、使細菌生長(cháng)連續進(jìn)行的一種培養方式。菌液濃度大小通過(guò)光電系統調節稀釋率來(lái)維持菌數恒定，此種培養方式一般用于菌體以及與菌體生長(cháng)平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)，從而獲得更好的經(jīng)濟效益。

恒濁器連續培養與恒化器連續培養的比較

    連續培養如用于生產(chǎn)實(shí)踐上，就稱(chēng)為連續發(fā)酵，連續發(fā)酵與單批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點(diǎn)： ① 高效，它簡(jiǎn)化了裝料，滅菌、生產(chǎn)時(shí)間和提高了設備的利用率； ② 自控，便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制； ③ 產(chǎn)品質(zhì)量較穩定； ④ 節約了大量動(dòng)力、人力等資源。

    連續培養或連續發(fā)酵也有其缺點(diǎn)。最主要的是菌種易于退化。其次易遭雜菌污染。此外營(yíng)養的利用率一般亦低于單批培養。

    在生產(chǎn)實(shí)踐上，連續培養技術(shù)已廣泛用于酵母菌體的生產(chǎn)，乙醇、乳酸和丙酮 - 丁醇等發(fā)酵。以及用假絲酵母進(jìn)行石油脫蠟或是污水處理中。